鹿紅顆粒對心肌缺血再灌注損傷大鼠腸道菌群的影響

楊天舒，瞿惠燕，戎靖楓，劉 茜，周 華

再灌注治療是有效保護缺血心肌免受梗死的有效方式，但是再次恢復血供后，心肌缺血再灌注損傷常常發生，不僅未能實現正常的心臟功能，反而加重其功能障礙和結構損傷。因此，心肌缺血再灌注損傷已成為心肌缺血病人術后心臟損傷的最主要原因，積極尋找心肌缺血再灌注損傷的機制及解決方法成為亟須解決的關鍵問題。

腸道作為人體最大免疫器官，在提取能量、控制局部和全身免疫方面扮演著重要角色。研究表明，腸道菌群與多種疾病發生、發展相關，如肥胖、糖尿病、胃腸疾病、癌癥和心血管疾病等[1]。其中，腸道菌群與心血管疾病的研究尤為引人關注[2]，其代謝產物如膽堿類物質，可導致心肌纖維化[3]。近年來，隨著人們飲食習慣的改變，瘦肉及蛋黃的攝取量增加，導致膽堿類食物食用過量。據報道，與健康人相比，患有冠心病病人的乳桿菌目明顯增加，擬桿菌門明顯減少[4]。說明患有冠心病的病人與正常人菌群結構有一定差異。鹿紅顆粒是上海中醫藥大學附屬曙光醫院周華教授運用中醫學“益氣溫陽，活血利水”理論，在總結多年臨床治療心臟重構經驗成果的基礎上，探索研制而成的中藥劑型，由鹿角、桂枝、黃芪、黨參、紅花和葶藶子組成。方中黃芪、黨參益氣健脾、扶正固本，對于提高腸道免疫力、調節腸道菌群紊亂有較好療效；鹿角、紅花、桂枝溫陽活血，給予腸道血供，防止腸黏膜充血水腫，改善腸黏膜屏障功能；葶藶子利水消腫，促進體循環中膽堿排泄。諸藥合用，共奏益氣健脾、活血利水之功效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品、試劑與儀器 鹿紅顆粒購自華潤三九醫藥股份有限公司；戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司(批號：57-33-0)；萬古霉素購自上海源液生物科技有限公司(批號：1404-93)。

1.1.2 動物 雄性成年健康無特定病原體(SPF)級Wistar大鼠40只，體質量(180±30)g，8周齡，購自上海中醫藥大學；飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，飼養室溫度25 ℃，濕度30%，光照周期12 h，自由進食普通標準飼料和飲用純凈水。實驗倫理證號：PZSHUTCM190322020。

1.1.3 儀器 動物呼吸機，江西特力公司(型號：TRCI-200A)；多導生理信號采集分析系統，美國 BIOPAC公司；全自動免疫分析儀，美國雅培公司(型號AXSYM)；微生物快速檢測系統(MB-80)， 北京金山川公司。全自動生化分析儀，美國Abbott公司(型號：AXSYM)；多功能超聲診斷儀(型號：IE33)荷蘭Philips公司；倒置顯微鏡(型號：4kx4l)。日本Olympus公司。

1.2 動物分組與造模 按照隨機原則對大鼠進行分組，分為假手術組、模型組、鹿紅顆粒組、萬古霉素組，每組10只。鹿紅顆粒組預處理，給予鹿紅顆粒0.5 mL/(kg·d)灌胃；萬古霉素組給予萬古霉素0.075 mg/(300 mL·d)；假手術組、模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組預處理灌胃5 d。

Wistar大鼠用2%戊巴比妥鈉進行麻醉，行氣管插管并用呼吸機輔助通氣(通氣頻率為80次/分、潮氣量為2～4 mL)。左側3～5肋間處打開胸腔，切開心包膜，擠壓出心臟后，在肺動脈下2～3 mm處用7號細線結扎冠狀動脈左前降支；結扎成功[心室前壁顯示蒼白色，心電圖Ⅱ導聯的ST段弓背向上升高(紙速50 mm/s)，表明結扎成功]后，迅速將心臟放回胸腔，然后用浸生理鹽水的紗布覆蓋胸腔，維持呼吸機呼吸，結扎后40 min再灌注180 min。假手術組只給予開胸后左前降支穿線，但不進行結扎。

1.3 檢測指標

1.3.1 血清檢測 大鼠處死后，取腹主動脈血，3 000 r/min離心10 min，即得到血清，根據試劑盒操作方法提示，利用全血信息分析系統檢測其心功能相關指標肌酸激酶。

1.3.2 病理染色 將大鼠心臟和小腸固定在4%多聚甲醛中，包埋在石蠟中，切成6 μm切片。心臟樣品用Masson染色以分析心肌纖維化。小腸用蘇木精-伊紅(HE)染色以分析組織形態。

1.3.3 糞便取樣測序 取大鼠直腸糞便樣品(約2粒)收集在無菌管中，短暫存放于液氮中，后儲存在-80 ℃等待檢測。使用E.Z.N.A.?soil 試劑盒 (Omega Bio-tek， Norcross， GA， U.S.)對總 DNA 進行抽提，利用 Nano Drop 2000檢測DNA 濃度和純度，再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取的質量；用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 引物對V3-V4 可變區間進行PCR 的擴增，擴增程序為：95 ℃預變性3 min，27個循環(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min(PCR儀：ABI GeneAmp?9700型)。擴增體系為20 μL、4 μL 5＊FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol dNTPs，0.8 μL引物(5 μmol)，0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA 模板。使用 2%瓊脂糖凝膠回收 PCR 產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences， Union City，CA，USA) 進行純化，Tris-HCl洗脫，利用2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST (Promega， USA) 進行檢測定量。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清肌酸激酶水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清肌酸激酶水平升高(P<0.05)；與模型組比較，鹿紅顆粒組及萬古霉素組大鼠血清肌酸激酶水平降低(P<0.05)；與萬古霉素組比較，鹿紅顆粒組大鼠血清肌酸激酶水平降低(P<0.01)。詳見圖1。

與假手術組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05；與鹿紅顆粒組比較，△ P<0.05。圖1 各組大鼠血清肌酸激酶水平比較

2.2 對心肌組織心肌纖維化病理學的影響 使用Masson染色觀察心肌組織病理學變化，藍色染色顯示心肌組織中的膠原纖維。與假手術組比較，模型組纖維化程度增加明顯；鹿紅顆粒組纖維化程度較輕，僅在血管周圍顯示纖維化反應；萬古霉素組較模型組纖維化程度較輕，但在血管周圍纖維化程度較鹿紅顆粒組重。詳見圖2。

圖2 各組大鼠心肌Masson染色切片圖

2.3 對盲腸組織病理學的影響 使用HE染色觀察盲腸組織中的病理學變化，假手術組大鼠腸絨毛排列整齊，間隙小；模型組間隙排列紊亂，絨毛間隙大，炎癥明顯；萬古霉素組絨毛排列較整齊，但間隙變大；鹿紅顆粒組絨毛排列整齊，較萬古霉素組改善了絨毛間隙。詳見圖3。

圖3 各組大鼠盲腸HE染色切片圖

2.4 大鼠腸道微生物群群落venn圖分析 通過venn圖分析發現，不同顏色代表不同分組，重疊部分數字代表多個分組中共有的物種數目，非重疊部分數字代表對應分組所特有的物種數目。通過venn圖發現，與假手術組(152)相比，模型組菌群豐度降低(143)；與模型組相比，鹿紅顆粒組(165)菌群豐度增加。與模型組(143)及鹿紅顆粒組(165)相比，萬古霉素組菌群豐度降低(140)。詳見圖4。

圖4 各組大鼠腸道微生物venn圖

2.5 大鼠腸道微生物群群落柱形圖分析 鹿紅顆粒在減緩心肌缺血再灌注損傷的同時影響了腸道微生物組成。模型組明顯增加大腸埃希菌(Escherichia)的豐度，假手術組及鹿紅顆粒組大腸埃希菌菌群豐度則較低，萬古霉素組大腸埃希菌的豐度較假手術組及鹿紅顆粒組的豐度提高，較模型組的豐度水平降低。詳見圖5。

圖5 大鼠腸道微生物群落

3 討 論

心血管疾病與腸道菌群相互聯系、相互作用[5-6]。經抗生素干預后，能明顯改善心肌損傷。究其機制是通過抑制腸道菌，降低血漿中內毒素水平，改善心肌缺血再灌注損傷。腸源性內毒素攻擊發生在89%的急性心肌梗死病人中，并且可能是疾病誘導或進展的一個因素[7]。研究證明，給予抗生素治療，在第14天效果達到最佳，其后易產生耐藥性，易打破菌群平衡，只能短期服用。而給予大鼠飲用水中添加萬古霉素，改變了糞便中存在的微生物種類的豐度并減少了總微生物數量。在抑制腸道有害菌的同時也抑制了腸道中“益生菌”[8]，因此，許多臨床試驗皆以失敗告終[9]。近年來，益生元和益生菌已廣泛用于治療某些疾病，并已顯示出很好的效果。而益生元品種過于單一，亟須研究多種藥物促進益生元及益生菌生長。

《黃帝內經·素問》云：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾。脾氣散精，上歸于肺；通調水道，下輸膀胱”。中藥在人體內代謝也要經歷此途徑。許多中草藥并不是本身發揮藥效，而是作為藥物前體，與腸道菌群相互作用。正常腸道主要的細菌門，按重要性順序依次是厚壁菌門、擬桿菌、放線菌、變形桿菌、疣粒菌和梭桿菌[10]。大腸埃希菌是人體不可缺少的單細胞生物。大腸埃希菌俗名大腸桿菌(革蘭陰性短桿菌)，周身鞭毛，能運動，無芽。大腸埃希菌的致病物質之一是血漿凝固酶。本研究結果證明，鹿紅顆粒減緩心肌缺血再灌注損傷的同時影響了腸道微生物組成，明顯增加了腸道微生物物種的多樣性與豐度。

長期吃低膳食纖維或高脂肪食物會導致腸道菌群失調，其細胞壁結構中的內毒素釋放，破壞腸道黏膜，造成腸壁滲漏，并可吸收入血[11]。心肌梗死發生后，導致心排血量減少和體循環淤血，一方面，可以導致腸道血流灌注減少，腸黏膜充血水腫，導致腸黏膜屏障功能破壞。腸黏膜屏障功能的這種破壞反過來可改變腸道通透性、細菌移位、循環內毒素水平。另一方面，可改變腸道菌群的種類與豐度。

鹿紅顆粒主要由鹿角、桂枝、黃芪、黨參、紅花及葶藶子組成，具有益氣活血、補腎調心的功效[12]。研究證明，含有纖維、多酚、多糖和某些其他物質的草藥配方，通過調節多種腸道微生物群，具有抗肥胖、抗糖尿病和抗心血管疾病的作用[13-15]。鹿紅顆粒所含的黃芪多糖、黨參多糖、桂枝多糖、黨參多酚、桂枝多酚等對于腸道益生菌有明顯促進作用[16]。鹿紅顆粒通過改善腸黏膜淤血以改善腸黏膜通透性，防治內毒素入血，從而改善心臟炎癥，改善心肌纖維化，減緩心肌缺血再灌注損傷。

腸道菌群種類繁多、數量龐雜，與多種疾病關聯密切。中醫藥因其來源天然，且有較少毒副作用，可為改善腸道菌群防治心血管疾病提供新思路。