芪丹利心丸減輕心肌梗死大鼠心肌凋亡的機制研究

劉珂珂，王 帥，吳愛明，侯雅竹，婁利霞，呂 夢，張冬梅，商洪才

心肌梗死可導致進行性心臟功能障礙甚至心力衰竭，具有較高的發病率和死亡率。在這一病理過程中，心肌細胞凋亡扮演了重要角色，其可在一定程度上決定梗死范圍的大小，進而影響疾病的進展[1]。細胞凋亡又稱程序性死亡，是一種嚴格受控的細胞自殺模式。凋亡能清除衰老及異常細胞，從而維持內環境的穩定，但心肌梗死后過度凋亡往往導致心肌細胞大量減少，心功能嚴重受損。抑制心肌細胞凋亡，可減輕心肌梗死后的心肌損傷，是防治心肌梗死的一種可行策略。

轉化生長因子-β(transforming growth factor-β， TGF-β)可以參與調控細胞生長、分化、凋亡等生物學過程。研究表明，TGF-β主要有3種亞型，它們在心肌梗死后受損心肌組織的愈合、修復過程中表達均上調[2]。TGF-β1和TGF-β2在心肌梗死早期即出現上調，而TGF-β3則是遲發及長時效上調[3]。其中，TGF-β1與凋亡的關系最為密切[4-7]，可通過TGF-β1/Smads信號通路參與細胞凋亡等多種過程，從而影響心肌梗死的轉歸。芪丹利心丸是天津中醫藥大學第一附屬醫院心內科的專利方，由黃芪、黨參、刺五加、丹參、葶藶子等組成，具有益氣活血利水之功。研究發現，芪丹利心丸治療心肌梗死的機制可能與TGF-β1/Smads信號通路有關[8]。據此推測芪丹利心丸可能會對心肌梗死后的心肌細胞凋亡產生積極治療作用。因此，本研究從凋亡通路角度研究芪丹利心丸治療心肌梗死的療效及機制，為其臨床應用提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，健康無特定病原體(SPF)級，體質量(180±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 主要試劑與藥品 戊巴比妥鈉(北京化學試劑公司，貨號：C06818794)；蘇木精伊紅(HE)染色液(南京建成科技有限公司，貨號：D006)；TGF-β (Abcam公司，貨號：ab92486)；Smad 2、Smad 3(Abcam公司，貨號：ab40855、ab40854)；Bcl-2、Bax(Proteintech公司，貨號：26593-1-Ap、60267-1-Ig)；Caspase-3、Caspase-9 (Abcam公司，貨號：ab184787、ab184786)；凋亡檢測試劑盒(Promega公司，貨號：G3250)。芪丹利心丸由天津中醫藥大學第一附屬醫院提供(專利號：ZL 201110413471.1)；卡托普利片(每片12.5 mg)由中美上海施貴寶制藥有限公司提供(批號：AAN9869)。

1.3 動物模型制備 參照文獻[9]建立心肌梗死大鼠模型，使用1%戊巴比妥鈉0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉后經喉氣管插管，心前區第3肋、第4肋間橫向開胸，在肺動脈圓錐與左心耳下約1 mm處用5/0手術線結扎左冠狀動脈前降支，見到心前區缺血變白且心電圖ST段抬高，即逐層縫合關胸，術后24 h不符合心肌梗死心電圖特征的動物予以剔除。假手術組操作同模型組，但只穿線不結扎。

1.4 分組給藥 將造模術后大鼠隨機分為假手術組、模型組、卡托普利組、芪丹利心丸組。芪丹利心丸組與卡托普利組參照文獻[10]進行等效劑量換算，相當于成人臨床用量的等效劑量。術后第2天開始，根據分組情況分別給予芪丹利心丸2.43 g/(kg·d)、卡托普利片2.25 mg/(kg·d)，假手術組和模型組給予等體積去離子水，連續灌胃4周。治療結束后每組各剩余10只動物。

1.5 HE染色 心肌組織經4%的多聚甲醛固定24 h，然后修剪、石蠟包埋、切片、烤片。常規脫蠟水化后，切片入蘇木素染3～8 min，自來水沖洗，光鏡下觀察，1%的鹽酸乙醇分化數秒，自來水沖洗返藍。接著切片入伊紅染液中染色1～3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察拍照。

1.6 蛋白質印跡法(Western Blot)檢測凋亡相關通路蛋白的表達 采用RIPA蛋白裂解法蛋白提取試劑盒提取左心室心肌組織中的總蛋白，冰上裂解45 min，間隔混勻組織液，裂解完成后于4 ℃12 000 g離心25 min，收集上清液，取樣稀釋，采用BCA法測定蛋白濃度，根據測定結果調整所有蛋白樣本使其為相同濃度。SDS-PAGE電泳分離，濕轉轉移至硝酸纖維膜上，用5%的脫脂奶粉常溫搖床封閉1 h，加入預先按說明書稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加對應的二抗室溫孵育1 h，以GAPDH為內參，TBST清洗后ECL顯色曝光得到蛋白條帶，并使用Image J軟件進行條帶分析。

1.7 原位末端標記測定(TUNEL)法檢測細胞凋亡 TUNEL染色按照試劑盒說明書進行，充分脫蠟、水化后，室溫平衡10 min，冰上配制反應液，37 ℃孵育60 min，終止并用PBS溶液沖洗以去除未加入的熒光素-12-dUTP，在心肌組織上滴一滴含DAPI的抗熒光衰減封片劑，用蓋玻片蓋住玻片并用透明甲油封住邊緣。立即在熒光顯微鏡(A1，ZEISS，德國)下進行圖像采集，設置標準熒光素濾光片，觀察熒光素在520 nm處表示凋亡核的綠色熒光以及在460 nm處藍色的全核。用Image-Pro Plus 6.0軟件計數凋亡細胞核和正常細胞核的數目，計算凋亡指數。

2 結 果

2.1 各組大鼠HE染色結果 假手術組心肌纖維排列整齊，染色均勻，細胞核大小形態基本一致；模型組心肌纖維排列紊亂，局部肌纖維斷裂；與模型組相比，各給藥組均在一定程度上得到改善，心肌纖維排列相對整齊。詳見圖1。

圖1 各組大鼠HE染色結果(×400)

2.2 各組大鼠TGF-β1/Smads通路蛋白表達的比較 與假手術組比較，模型組TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，芪丹利心丸組和卡托普利組TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達降低(P<0.05)。詳見圖2。

2.3 各組大鼠凋亡相關蛋白表達的比較 與假手術組比較，模型組大鼠的Bcl-2表達降低(P<0.01)，Bax表達升高(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)；與模型組比較，芪丹利心丸組與卡托普利組Bcl-2表達增加(P<0.05)，Bax表達減少(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值增加(P<0.05)。在Caspase凋亡蛋白表達方面，與假手術組比較，模型組Caspase-9和Caspase-3表達均增加(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，芪丹利心丸組Caspase-9和Caspase-3表達均降低(P<0.05或P<0.01)，卡托普利組Caspase-9表達降低(P<0.01)，Caspase-3表達雖有降低趨勢，但無統計學意義。詳見圖3。

與假手術組比較，＊ P<0.05，＊＊ P<0.01；與模型組比較，# P<0.05，## P<0.01。圖3 各組大鼠凋亡相關蛋白表達的比較(n=3)

2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡的比較 與假手術組比較，模型組心肌細胞凋亡指數增高(P<0.05)；與模型組比較，芪丹利心丸組和卡托普利組心肌細胞凋亡指數降低(P<0.05)。詳見圖4。

與假手術組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。圖4 各組大鼠心肌細胞凋亡的比較(n=10)

3 討 論

心肌梗死是嚴重的心血管疾病，在全球范圍內呈現較高的發病率和死亡率[11-12]。心肌梗死后梗死周圍心肌細胞發生凋亡或壞死，導致局部心肌細胞數目大量減少，臨床表現為進行性心功能下降甚至心力衰竭。有研究表明，凋亡細胞占梗死區所有丟失細胞的86%，表明其是導致心肌細胞丟失的主要原因[13]。而心肌細胞數量與心功能密切相關，因此，抑制心肌細胞凋亡對于提高心肌梗死病人的心功能及改善預后意義重大[14-15]。

中醫藥在防治心肌梗死方面有著確切的臨床療效[15-16]，其機制與減輕心肌細胞凋亡密不可分[17-18]。芪丹利心丸是依據益氣活血利水治則創制的專利方，近期文獻報道，其能夠調控TGF-β1的表達繼而改善心肌梗死后的心肌纖維化[8，19]。目前研究認為，TGF-β1的作用十分廣泛，除調控纖維化以外，也參與了凋亡過程，可通過TGF-β1/Smads信號通路導致凋亡的激活[4-7]。因此，芪丹利心丸對心肌細胞凋亡的影響和機制值得進一步研究。

本研究結果表明，心肌梗死大鼠TGF-β1/Smads信號通路發生了過度激活，芪丹利心丸能夠降低TGF-β1及下游Smad 2、Smad 3的表達，這與文獻報道[8，19]一致。本研究在此基礎上進一步觀察了芪丹利心丸對凋亡通路中Bcl-2、Bax以及Caspase蛋白表達的影響。研究結果表明，心肌梗死大鼠Bcl-2蛋白表達減少而Bax蛋白表達增加，并且Bcl-2/Bax比值減小，而芪丹利心丸可顯著改善Bcl-2和Bax蛋白的異常表達。對于細胞凋亡，可看作是一個由Bcl-2家族和Caspase家族蛋白質執行程序化、規范化命令的過程，Bcl-2、Bax以及Caspase蛋白在其中發揮了重要作用[20-22]。Bcl-2蛋白作為Bcl-2家族中的保護性蛋白，廣泛存在于核膜外、內質網膜及線粒體內膜而抑制凋亡的發生，Bax蛋白作為Bcl-2蛋白同源體可促進凋亡的發生。Bcl-2和Bax的比值直接決定了線粒體外膜各種通道的開放程度，使其通透性發生改變，引起細胞色素C的釋放，進而導致Caspase通路的活化和凋亡的發生。本研究結果表明，心肌梗死后Caspase-9和Caspase-3表達增加。Caspase-9和Caspase-3是Caspase家族中的關鍵蛋白，心肌缺血后，細胞色素C從線粒體內釋放到胞漿與Apaf-1結合，募集并激活Caspase-9，進而激活下游的Caspase-3，啟動凋亡程序[20]。因此，心肌梗死大鼠的心肌細胞凋亡指數明顯增加。本研究中芪丹利心丸可降低Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達，減少心肌細胞凋亡。

綜上所述，本研究表明芪丹利心丸能夠減輕心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡，其機制與調節TGF-β1/Smads信號通路，改善Bcl-2、Bax及Caspase蛋白表達有關。