丹參酮ⅡA通過NF-κB通路抑制脂多糖誘導人臍靜脈血管內皮細胞炎性反應的作用機制

何德全，陳友權，王世祥

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是指以動脈內膜有脂質等血液成分的沉積、平滑肌細胞增生和膠原纖維增多，形成粥糜樣含脂壞死病灶和血管壁硬化為主要表現的一種疾病，是心血管疾病的主要病理基礎，由動脈粥樣硬化導致的心血管疾病已經成為全球死亡的首要原因[1]。目前，越來越多的證據表明，動脈粥樣硬化是一種炎癥和免疫性疾病。研究顯示，血管內皮細胞作為血管壁的重要組成部分，其損傷所導致的異常增殖和凋亡是動脈粥樣硬化性疾病發生、發展的共同病理生理基礎[2-3]。核轉錄因子-κB(NF-κB)是一類具有啟動基因轉錄功能的蛋白質，存在于包括心血管細胞在內的多種細胞中，調控細胞的生存、免疫、增殖和凋亡等一系列生理病理過程[4]。NF-κB的活化對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的釋放起決定性作用。持續激活的NF-κB通過促進TNF-α、白細胞介素-6(IL-6)等細胞因子的表達促發一系列免疫炎性反應，導致細胞損傷。因此，適當抑制NF-κB的活化對心肌重構有積極治療作用[5]。丹參酮ⅡA是丹參的脂溶性有效單體，具有抗氧化、抑制血小板聚集和抗凝血、抑制平滑肌細胞的增殖、擴張冠狀動脈及抗炎的作用，是一種天然的抗動脈粥樣硬化藥物[6]。Yang等[7]研究表明，在內皮祖母細胞中丹參酮ⅡA可以通過抑制NF-κB活性，下調TNF-α依賴的血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)的表達。因此，丹參酮ⅡA不僅具有抗炎癥的作用，還具有潛在的抗動脈粥樣硬化作用。本研究擬觀察丹參酮ⅡA通過NF-κB通路對脂多糖致人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)損傷的保護作用，為臨床動脈粥樣硬化治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 丹參酮ⅡA(純度98%)購自成都普瑞法公司，HUVECs購自中國科學院上海細胞生物學研究所，脂多糖購自美國Sigma公司，RPMI-1640培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁研究所，酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自美國BOSTER公司，RIPA裂解液購自北京索萊寶公司，兔抗VCAM-1單克隆抗體購自英國Serotec公司，TNF-α、白細胞介素-1β(IL-1β)p65、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)和GAPDH單克隆抗體和山羊抗兔(鼠)IgG二抗購自美國Cell Signaling Technology公司，Triton X-100 購自美國Amresco公司，TRITC標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司，PVDF膜購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HUVECs用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，置于37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養，傳代時用0.25%胰蛋白酶進行消化，一般2 d換1次培養基，以保證細胞所需的營養成分。

1.2.2 脂多糖濃度篩選 將HUVECs按照2×105個/mL分別接種到96孔板上，每孔200 μL。置于37 ℃、5%二氧化碳培養箱中孵育24 h，至細胞貼壁。棄去上清液，空白組加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，對照組加入培養基，其余各組分別加入不同濃度(0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)的脂多糖培養基，每孔200 μL，每組設置6個復孔。置于37 ℃，5%二氧化碳培養箱中孵育12 h后加入CCK-8，輕輕震蕩均勻后放入37 ℃、5%二氧化碳培養箱中孵育30 min，于酶標儀450 nm處測定各孔光密度(OD)值。按照公式計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3 不同濃度丹參酮ⅡA對脂多糖損傷的HUVECs的保護作用 將HUVECs按照2×105個/mL分別接種到96孔板上，每孔200 μL。置于37 ℃、5% 二氧化碳培養箱中孵育24 h，至細胞貼壁。棄去上清液，空白組加入PBS溶液，對照組加入培養基，脂多糖模型組與用藥組分別加入含有脂多糖培養基，每孔200 μL，每組設置6個復孔。置于37 ℃、5%二氧化碳培養箱中孵育12 h之后，棄去上清液，空白組加入PBS溶液，對照組和脂多糖模型組加入完全培養基，其余各組加入不同濃度(0.1 μg/mL、1.0 μg/mL、3.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL)的丹參酮ⅡA，每孔200 μL。置于37 ℃、5%二氧化碳培養箱中孵育6 h后，加入CCK-8，輕輕震蕩均勻后放入37 ℃、5%二氧化碳培養箱中孵育30 min，于酶標儀450 nm處測定各孔OD值。按照公式計算細胞存活率。

1.2.4 酶聯免疫吸附法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6和白細胞介素-10(IL-10)含量 處理18 h后各組細胞收集于離心管中，1 000 r/min離心5 min，收集上清液，按酶聯免疫吸附試驗試劑盒操作說明檢測上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10含量。

1.2.5 流式細胞儀檢測各組細胞中VCAM-1表達情況 各組細胞處理18 h后，棄去培養基，用PBS清洗兩次。用胰蛋白酶消化細胞，加入適量的PBS溶液重懸細胞，1 000 r/min離心5 min。棄上清后，再用含新鮮胎牛血清的緩沖液重懸細胞，成為單細胞懸液，室溫下與VCAM-1單克隆抗體避光冰上孵育30 min，再用PBS沖洗細胞，1 000 r/min離心5 min，離心后細胞加入含多聚甲酸的PBS緩沖液中，固定30 min，使用同型對照單克隆抗體確定背景。固定后的單細胞懸液1 000 r/min離心5 min，離心后棄去上清液，用含1%多聚甲醛液重懸細胞，做好每管細胞標記，上機檢測。選用流式細胞儀對細胞進行表面抗原檢測，并用配套軟件進行結果分析。實驗獨立重復3次。

1.2.6 免疫細胞化學染色法檢測各組細胞中VCAM-1表達水平 各組細胞處理18 h后，用PBS洗滌3次；10%甲醛固定30 min，PBS洗滌3次；0.2% TritonX-100作用30 min，PBS洗滌3次，用含10%血清封閉20 min；棄去血清，分別加入稀釋后的兔抗VCAM-1單克隆抗體，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，加入稀釋的TRITC標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h；甘油封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.7 蛋白質印跡法(Western Blot)檢測NF-κB信號通路相關蛋白表達情況 各組細胞處理18 h后用蛋白酶抑制劑裂解液裂解細胞后提取蛋白，用BCA法測定總蛋白含量。取等量蛋白質樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質后轉膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，之后加入稀釋后的TNF-α、NF-κB、IκBα、GAPDH一抗，4 ℃搖床上孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次10 min，加入對應于一抗種屬來源的HRP標記的二抗，在室溫搖床上孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL化學發光液顯色發光，凝膠成像系統拍照，Image Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶進行分析。

2 結 果

2.1 脂多糖誘導HUVECs損傷模型的建立(脂多糖濃度篩選) 在所選定的濃度梯度范圍內，脂多糖對HUVECs的增殖有明顯抑制作用，且隨著濃度上升而抑制率逐漸增加。當脂多糖質量濃度為100 μg/mL時，CCK-8檢測到的細胞存活率為47.5%，此時細胞損傷適中(P<0.01)。因此，本實驗確定100 μg/mL的脂多糖為誘導HUVECs損傷劑量。詳見表1。

表1 脂多糖對HUVECs損傷細胞存活率的影響(±s) 單位：%

2.2 丹參酮ⅡA對脂多糖損傷HUVECs的保護作用 脂多糖誘導HUVECs后，脂多糖模型組相對于對照組的吸光度明顯降低(P<0.05)，而與脂多糖模型組比較，在0.1～5.0 μg/mL內，不同濃度的丹參酮ⅡA能明顯提高損傷后HUVECs細胞活性，具有明顯的保護作用，但在10.0 μg/mL時，HUVECs的增殖明顯減少，故對損傷后的HUVECs 起保護作用的丹參酮ⅡA濃度應該控制在0.1～5.0 μg/mL。在后續實驗中丹參酮ⅡA濃度選擇5.0 μg/mL。詳見表2。

表2 丹參酮ⅡA對脂多糖損傷HUVECs的保護作用(±s) 單位：%

2.3 丹參酮ⅡA對脂多糖損傷HUVECs培養液中TNF-α等含量的影響 與對照組比較，脂多糖模型組HUVECs培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均增加(P<0.01)，IL-10含量減少(P<0.01)；與脂多糖模型組比較，丹參酮ⅡA組HUVECs培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均減少(P<0.05或P<0.01)，IL-10含量增加(P<0.05)。詳見表3。

表3 丹參酮ⅡA對TNF-α及IL-1β、IL-6、IL-10含量的影響(±s)

2.4 流式細胞術檢測HUVECs中VCAM-1的表達情況 在用脂多糖刺激細胞18 h后，通過流式細胞術分析評估VCAM-1在HUVECs表面上的表達。與對照組比較，脂多糖刺激誘導HUVECs表面上的VCAM-1表達增加(見圖1A)。如圖1B所示，與對照組相比，用脂多糖刺激18 h增加了平均熒光強度(P<0.001)；丹參酮ⅡA顯示出對脂多糖刺激的抑制作用，即平均熒光強度降低(P<0.05)。詳見圖1。

與對照組比較，＊ P<0.001；與脂多糖模型組比較，# P<0.05。圖1 丹參酮ⅡA對脂多糖損傷HUVECs中VCAM-1表達的影響(A為VCAM-1的流式圖；B為VCAM-1平均熒光強度)

2.5 丹參酮ⅡA對脂多糖損傷HUVECs中VCAM-1表達水平 對照組細胞質中有弱VCAM-1蛋白熒光表達，脂多糖模型組細胞質中有強VCAM-1蛋白熒光表達，而丹參酮ⅡA組中VCAM-1熒光表達弱于脂多糖模型組。詳見圖2。

2.6 丹參酮ⅡA對脂多糖損傷HUVECs中TNF-α、NF-κB p65和IκBα表達的影響 與對照組比較，脂多糖模型組HUVECs中TNF-α、NF-κB p65蛋白表達均上調(P<0.01)，IκBα蛋白表達下調(P<0.01)；與脂多糖模型組比較，丹參酮ⅡA組HUVECs中TNF-α、NF-κB p65蛋白表達均下調(P<0.05)，IκBα蛋白表達上調。詳見圖3。

與對照組比較，＊ P<0.01；與脂多糖模型組比較，# P<0.05。圖3 Western Blot法檢測HUVECs中TNF-α、NF-κB p65和IκBα蛋白表達情況(A為蛋白印跡圖；B為蛋白表達量)

3 討 論

動脈粥樣硬化與脂代謝紊亂、內皮細胞損傷、血管平滑肌細胞增殖、炎癥反應等密切相關[8]，其早期的特征是血管內皮屏障功能和結構改變，影響管腔和管壁之間分子和溶質的運輸，導致低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和白細胞更容易在內膜中沉積和浸潤[9]。而之后出現的血管內皮損傷則是動脈粥樣硬化斑塊及再狹窄發生、發展的重要因素。內皮細胞損傷是導致心血管疾病的起始環節和重要指標，其損傷主要由炎癥和氧化應激作用兩大途徑引起[10]。

NF-κB是近年來研究較多的核轉錄激活因子，可調控細胞因子、免疫分子等多種基因的表達，p65是其最常見的1個亞基[11]。生理情況下NF-κB磷酸化位點被IκB封閉，處于無活性狀態。在各種炎性損傷時，上游IKK激酶降解IκB后，使p65迅速轉移至核內，p65能識別特定的DNA序列，與某些炎性因子基因啟動區或增強子上的κB位點結合，啟動相關基因轉錄，誘導多種細胞因子過量表達，進一步反饋激活NF-κB，從而放大炎癥級聯反應[12]。在炎癥發生中NF-κB可誘導包括炎性因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、VCAM-1等在內的多種炎性介質的表達。

丹參為唇形科植物丹參的干燥根及根莖，其中丹參酮ⅡA是丹參的主要活性成分之一，是丹參脂溶性成分的代表，對于治療冠心病、心絞痛、心動過速、腦出血均有顯著療效[13]。賈連群等[14]使用脂多糖誘導的HUVECs的EA.hy926炎癥反應，使用丹參酮ⅡA對炎癥反應下的HUVECs進行刺激，發現TLR4和TNF-α的表達明顯受到抑制，并認為抑制TLR4和TNF-α的表達是丹參酮ⅡA抗動脈粥樣硬化作用的可能機制之一。

本研究發現，當脂多糖濃度為100 μg/mL時，細胞抑制率為47.5%，因此，確定誘導濃度為100 μg/mL(P<0.01)。在0.1～5.0 μg/mL內，不同濃度的丹參酮ⅡA能明顯提高損傷后的HUVECs細胞活性，但在10 μg/mL時，HUVECs的增殖明顯減少(P<0.01)，因此，后續試驗丹參酮ⅡA濃度選擇為5.0 μg/mL。與對照組比較，脂多糖模型組HUVECs培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均增加(P<0.01)，IL-10含量減少(P<0.01)；與脂多糖模型組比較，丹參酮ⅡA組HUVECs培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均減少(P<0.05或P<0.01)，IL-10含量增加(P<0.05)，說明丹參酮ⅡA能抑制炎性反應。與對照組比較，脂多糖刺激誘導HUVECs中VCAM-1的表達增加，也增加了平均熒光強度(P<0.001)，丹參酮ⅡA組顯示出對脂多糖刺激的抑制作用，即平均熒光強度降低(P<0.05)。對照組細胞質中有弱VCAM-1蛋白熒光表達，脂多糖模型組細胞質中有強VCAM-1蛋白熒光表達，而丹參酮ⅡA組中VCAM-1熒光表達弱于脂多糖模型組，提示丹參酮ⅡA能抑制VCAM-1的表達。與對照組比較，脂多糖模型組HUVECs中TNF-α、NF-κB蛋白表達均上調(P<0.01)，IκBα蛋白表達下調(P<0.01)，與脂多糖模型組比較，丹參酮ⅡA組HUVECs中TNF-α、NF-κB p65蛋白表達均下調(P<0.05)，IκBα蛋白表達上調。

綜上所述，丹參酮ⅡA可通過抑制 NF-κB炎癥信號途徑，抑制炎性因子產生來減輕脂多糖對內皮細胞的損傷。丹參酮ⅡA在動脈粥樣硬化防治方面具有進一步研究意義，具體的作用機制還有待體內和體外研究來證明。