兩種結核感染T細胞檢測試劑盒性能評估

潘建華，張 玲，李艷紅，周銳雄，余俊鵬，楊錦鴻

廣州金域醫學檢驗中心血液室/廣州醫科大學金域檢驗學院，廣東廣州 510330

結核病是由結核分枝桿菌(MTB)感染導致的一種慢性傳染病。肺外結核感染臨床表現較為隱匿，癥狀不典型，容易導致誤診、漏診[1]。常規的MTB培養需要時間較長，培養條件要求較高，而且易受到標本質量和MTB數量的影響，陽性率僅為30%，痰涂片檢出率也相對較低[2]。近年來，MTB感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)越來越受到關注，其利用酶聯免疫斑點法(ELISPOT)檢測是否存在MTB感染T淋巴細胞后分泌的特異性細胞因子干擾素-γ(IFN-γ)來判斷有無MTB感染[3]。多項研究表明，T-SPOT.TB在診斷MTB感染方面具有靈敏度高、特異性強的特點，目前已在臨床上廣泛應用[4-8]，而目前市場推廣較為廣泛的進口試劑由于價格昂貴，不能在臨床上普及使用，因此，選擇一種經濟、快速、準確地診斷MTB感染的檢測方法對于結核病的防治至關重要。本研究通過多家實驗室驗證評估國產與進口同類T-SPOT.TB產品的檢測性能，現報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 來自廣州金域(112份)、杭州金域(88份)、福州金域(64份)、成都金域(80份)、沈陽金域(64份)檢驗中心的臨床標本，共408份，來源患者中男215例，女193例；年齡2～83歲，中位年齡47歲。金域體檢中心50份T-SPOT.TB檢測體檢標本，體檢者中男25例，女25例；年齡25～48歲，中位年齡35歲；所有體檢人員HIV抗體檢測均為陰性。

1.2儀器與試劑 參比試劑盒由英國Oxford Immunnotec公司提供，考核試劑由北京同生時代生物技術有限公司提供。使用儀器包括安徽嘉文儀器裝備有限公司生產的JW-1050R低速冷凍離心機、日本Panasonic生產的CO2培養箱，濟南鑫貝西生物技術有限公司生產的BIOBASEⅡ級生物安全柜，美國CTL公司生產的酶聯免疫熒光斑點分析儀。淋巴細胞分離液、RPMI-1640培養基分別由上海復星醫學科技發展有限公司和北京同生時代生物技術有限公司提供。

1.3方法 對458份標本分別使用參比試劑(進口)和考核試劑(國產)進行ELISPOT，提取外周血單個核細胞刺激培養進行斑點計數判斷結果，對兩種試劑檢測結果進行Kappa檢驗，以Kappa值≥0.75為兩者一致性較好。

1.3.1標本采集 采血量：肝素抗凝全血，2歲以下兒童2～3 mL，其他年齡受試者4～6 mL，免疫力低下或白細胞計數降低的受試者6～8 mL。標本存儲：標本室溫(15～25 ℃)保存及運輸，不得冷凍或冷藏，建議24 h內送至實驗室，室溫保存不應超過32 h。

1.3.2檢測方法 所有操作均按照試劑盒說明書進行，參比試劑采用ELISPOT對早期分泌抗原靶6 000(ESAT-6)和培養濾液蛋白10 000(CFP-10)有反應的T細胞進行斑點計數；考核試劑采用ELISPOT對復合抗原ESAT-6/CFP-10/Esx-1底物蛋白Rv3615c(Rv3615c)有反應的T細胞進行斑點計數。

1.4判斷標準

1.4.1參比試劑結果判斷 參比試劑檢測結果包括陰性對照孔和陽性對照孔、抗原A和抗原B結果。(1)試驗有效的標準：陰性對照孔內斑點計數<10個，且陽性對照孔內斑點計數>20個。(2)陽性結果判斷標準：①陰性對照孔斑點計數<6個，且抗原A或抗原B孔的斑點計數—陰性對照孔斑點計數的結果>6個；②陰性對照孔斑點計數>6個，且抗原A 或抗原B孔的斑點計數>2倍陰性對照孔斑點計數。滿足陽性結果判斷標準任意一條即為陽性，否則為陰性。

1.4.2考核試劑結果判斷 考核試劑結果包括陰性對照孔、檢測孔、陽性對照孔結果。當陰性對照孔斑點計數為0～5個時，考核試劑結果判斷方法見表1。

表1 考核試劑結果判斷

1.5統計學處理 兩種試劑檢測的數據采用Kappa一致性檢驗分析。

2 結 果

2.1考核試劑與參比試劑對臨床標本的檢測結果一致性 408份臨床標本中，400份標本兩種試劑檢測結果一致，其中有8份標本兩種試劑檢測結果不一致，考核試劑檢測為陽性，參比試劑檢測為陰性，兩種試劑的檢測結果總一致率為98.04% (Kappa=0.96)。廣州金域檢驗中心一致率為96.43%(Kappa=0.93)； 杭州金域檢驗中心一致率為97.73%(Kappa=0.95)； 福州金域檢驗中心一致率為98.44%(Kappa=0.97)；成都金域檢驗中心一致率為98.75%(Kappa=0.97)； 沈陽金域檢驗中心一致率為100.00%(Kappa=1.00)。見表2。

2.2考核試劑與參比試劑對體檢標本的檢測結果一致性 50份體檢標本中，49份標本兩種試劑檢測結果均與臨床診斷符合，1份標本考核試劑檢測結果為陽性(斑點計數為5個)，參比試劑為陰性，兩種檢測試劑一致率為98.00%(49/50)。見表2。

表2 兩種試劑檢測結果比較

續表2 兩種試劑檢測結果比較

3 討 論

病原學檢查常作為診斷結核病的金標準，如痰涂片常用于肺結核的診斷，但其受制于痰液取樣及痰中MTB數量的影響，故靈敏度較低，且無法診斷肺外結核及不咳痰結核病，使其應用受到一定的限制[9]。MTB感染者外周血中存在MTB特異的活化效應T細胞，這些T細胞在受到ESAT-6和CFP-10刺激后分泌細胞因子，其中包括IFN-γ。臨床常通過檢測IFN-γ的量和ELISPOT提取外周血單個核細胞刺激培養進行斑點計數，從而推測體內是否存在對MTB反應的效應T細胞，進一步對MTB感染情況進行輔助診斷。本研究兩種試劑均采用ELISPOT原理，并同時設有陰性和陽性對照評估試驗可靠性。ELISPOT應用于結核病診斷已近20年[10-11]，能夠檢測出1/100 000～1/50 000的外周血單個核細胞中經抗原刺激后釋放細胞因子的細胞，現已成為最敏感的檢測方法之一。

本研究結果顯示，考核試劑的檢測性能不僅與參比試劑的檢測性能一致性較好，而且在MTB陽性檢出率方面優勢更為突出，文中有8份標本考核試劑檢測為陽性，而參比試劑檢測為陰性，其中有6份陽性標本來源患者臨床診斷為肺部疾病或有結核癥狀和治療史，有2份標本陽性待確診，尚不能排除假陽性的可能，分析原因可能與各自試劑抗原組合有關，參比試劑是通過ELISPOT檢測MTB 特異性抗原ESAT-6和CFP-10刺激T淋巴細胞釋放的IFN-γ進行檢測，為單抗原判讀結果，容易造成一定比例的漏檢，而考核試劑是采用復合三抗原(ESAT-6/CFP-10/Rv3615c)刺激T淋巴細胞釋放的IFN-γ，增加了檢測敏感性， MTB引起的機體免疫反應是多個抗原共同起作用的結果，而考核試劑在基礎抗原ESAT-6、CFP-10基礎上，增加了ESX-1底物蛋白Rv3615c抗原。 Rv3615c是免疫原性較強的靶抗原，其基因表達依賴MTB基因組RD1區，包含了多個肽段的集合體，可被MTB感染者T細胞識別。采用抗原三合一技術，更能模擬人體內MTB引起的免疫反應，在巨噬細胞的吞噬體內活躍表達，更接近體內的真實情況，所以，運用復合抗原EAST-6/CFP-10/Rv3615c篩查MTB可提高結核病患者和潛伏結核感染人群的檢出率。

綜上所述，金域集團5家連鎖檢驗中心同時用考核試劑和參比試劑對408份臨床標本進行驗證，均獲得較高的檢出率，兩種試劑檢測結果有較高的一致性，檢驗性能尚未發現有本質區別，對MTB感染的輔助診斷均具有指導意義。