等位基因特異性PCR結合金磁微粒免疫層析檢測膀胱癌患者尿液中TERT突變*

郜趙偉，王會平，劉 沖，和 婷，劉 麗，董 軻

空軍軍醫大學第二附屬醫院檢驗科，陜西西安 710038

端粒位于染色體末端，對維持染色體穩定和調控細胞凋亡具有重要作用[1]。端粒酶通過向端粒末端添加重復序列維持端粒長度，端粒酶活性與細胞增生、分化和不死性密切相關，是腫瘤發生的研究熱點[2-5]。端粒酶逆轉錄酶(TERT)是端粒酶的蛋白活性成分，由位于染色體5p15.33的TERT基因編碼[6]。TERT啟動子序列位于轉錄起始點附近的富于GC區，對端粒酶活性具有關鍵調控作用[7-8]。研究顯示，TERT啟動子存在2個高頻突變位點C228T和C250T[9-11]。啟動子區域突變導致TERT相對表達水平異常升高，進而上調端粒酶活性，破壞細胞凋亡調控，使細胞獲得無限增殖能力，發生癌變[12-13]。研究顯示，TERT啟動子區域突變存在于多種類型的腫瘤中[14-19]，尤其在膀胱癌中，TERT突變頻率在所有突變基因中排名第一。研究表明，TERT啟動子區域突變與膀胱癌的進展、復發及轉移相關[20-22]。因此，TERT啟動子區域突變檢測對膀胱癌患者的診斷及預后監測具有重要意義，尤其是以患者尿液為檢測對象，實現無創檢測，具有重要臨床應用價值。本文建立了一種TERT啟動子區域突變的檢測方法，可用于檢測尿液DNA中TERT啟動子區域的C228T突變和C250T突變，為TERT啟動子區域突變檢測在膀胱癌患者診斷及預后監測中的臨床應用提供依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 TERT-C228T純合突變細胞系U251來自本實驗室；TERT-C250T雜合突變的基因組DNA來自本實驗室；DMEM培養基購自美國Invitrogen公司，小牛血清購自杭州四季青公司；基因組提取試劑盒(D3392-02)購自美國OMEGA生物技術公司；引物合成及測序委托西安擎科生物技術公司完成；Taq Mix購自西安潤德生物技術公司；金磁微粒檢測板購自西安金磁納米生物技術公司；膀胱癌患者尿液取自本實驗室，患者留取尿液至尿杯中，除吸取足量尿液用于體液指標檢驗外，尿杯中剩余標本轉移至15 mL離心管中，提取DNA。

1.2方法

1.2.1基因組提取 培養U251細胞，采用10%小牛血清的DMEM培養液，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養。取患者尿液10～15 mL，轉速5 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液，收集尿沉渣，200 μL的PBS重懸，收集1×106個細胞，利用OMEGA基因組提取試劑盒提取DNA。

1.2.2引物設計 根據等位基因特異性PCR原理，利用Primer Premier 5軟件設計TERT啟動子區域228和250位點基因型檢測引物，包括野生型PCR引物對(-WT，3′端堿基為野生型)和突變型PCR引物對(-M，3′端堿基為突變型)；Sanger測序鑒定采用PCR引物對(TERT-seq)；生物素(上游引物)和地高辛(下游引物)標記PCR引物，引物委托西安擎科澤西生物公司進行合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3等位基因特異性PCR 利用無標記的等位基因特異性PCR引物進行PCR，采用梯度PCR確定退火溫度，PCR體系：DNA模板3.0 μL；上游+下游引物(10 μmol)0.5 μL；2×Tag mix 10.0 μL；滅菌水6.5 μL；PCR反應程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 20 s；60～78 ℃ 1 min；30個循環；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。共選擇18個退火溫度，根據凝膠電泳檢測結果，確定最佳PCR條件。

1.2.4等位基因特異性PCR結合金磁微粒免疫層析檢測 利用生物素和地高辛標記的引物進行等位基因特異性PCR，將10.0～20.0 μL的等位基因特異性PCR產物加入金磁微粒檢測板，室溫靜置5 min，讀取檢測結果，質控線和檢測線均顯示條帶即表示DNA攜帶有相應位點突變。利用TERT-seq引物對DNA模板進行PCR擴增，回收PCR產物，進行測序鑒定，與金磁微粒檢測板顯示結果進行比對。

2 結 果

2.1等位基因特異性PCR程序建立 根據梯度PCR結果，確定TERT228位點基因型檢測的等位基因特異性PCR反應程序：94 ℃ 10 min; 94 ℃ 20 s,78 ℃ 1 min,30個循環; 72 ℃ 5 min,4 ℃保存。利用上述程序，采用TERT228-M引物可以特異性地識別攜帶有TERT-C228T突變的DNA模板，并擴增出DNA片段，而無法識別和擴增TERT野生型DNA片段，見圖1；相反，采用TERT228-WT引物可特異性識別并擴增TERT野生型DNA片段，而無法識別和擴增攜帶有TERT-C228T突變型DNA片段。

注：A表示C228T突變的等位基因特異性PCR；模板為U251 DNA；1表示TERT228-WT；2表示TERT228-M；3表示TERT250-WT；4表示TERT250-M；M表示Takara DL2000 DNA marker。B表示C250T突變的等位基因特異性PCR;模板為C250T突變DNA；1表示TERT250-WT；2表示TERT250-M；3表示TERT228-WT；4表示TERT228-M；M表示Takara DL2000 DNA marker。

確定TERT250位點檢測的PCR反應程序：94 ℃ 10 min; 94 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min,30個循環; 72 ℃ 5 min,4 ℃保存。利用上述程序，采用TERT250-M引物可以特異性地識別攜帶有C250T突變的DNA模板，并擴增出DNA片段，而無法識別和擴增TERT野生型DNA片段。上述結果表明，本文設計的特異性引物和程序可用于檢測TERT啟動子區域C228T和C250T突變。見圖1 。

2.2等位基因特異性PCR結合金磁微粒免疫層析檢測 以TERT-C228T突變的U251細胞DNA、TERT-C250T突變的DNA為模板，分別利用生物素或地高辛標記的Labeled或TERT228-M和Labeled或TERT250-M引物，進行等位基因特異性PCR擴增，PCR產物加入金磁微粒檢測板進行檢測，見圖2A、C。PCR產物經Sanger測序驗證，等位基因特異性PCR結合金磁微粒免疫層析檢測結果與測序結果一致，見圖2B、D。

2.3尿液DNA的TERT啟動子區域突變檢測 等位基因特異性PCR結合金磁微粒免疫層析方法檢測34例膀胱癌患者尿液DNA中的TERT啟動子區域突變情況。結果顯示，其中8例(23.53%)患者尿液DNA中存在TERT-C228T突變，1例(2.94%)患者尿液DNA中存在TERT-C250T突變。

注：A表示結合金磁微粒免疫層析的C228T突變，B表示結合Sanger測序檢測的C228T突變,C表示結合金磁微粒免疫層析的C250T突變,D表示結合Sanger測序檢測的C250T突變。

3 討 論

端粒酶活性對于細胞永生化具有重要作用，而TERT則是端粒酶活性的關鍵成分。TERT在衰老或損傷的細胞中是陰性的，端粒縮短導致DNA損傷應答途徑的激活和細胞凋亡，然而，在腫瘤細胞中，TERT相對表達水平增強，維持腫瘤細胞端粒長度，進而逃避細胞凋亡，使腫瘤細胞獲得無限增殖的能力。TERT啟動子區域活性的增強對TERT表達上調具有重要作用。2013年有研究報道，TERT啟動子區域在惡性黑色素瘤細胞中發生突變，最常見的2個突變位點為C228T和C250T，此突變會形成新的轉錄因子結合位點，導致TERT轉錄活性異常升高[23-24]。目前，已在泌尿系統(突變率11.55%)、乳腺組織(突變率1.67%)、宮頸組織(突變率2.06%)等多種類型的組織中發現TERT啟動子區域突變現象。腫瘤基因突變數據庫顯示，TERT在膀胱癌中的突變率為12.00%。TERT啟動子區域突變檢測對膀胱癌患者診斷、病理分級、預后監測具有重要價值。研究表明，尿液中TERT啟動子區域突變檢測有助于早期發現治療后膀胱癌患者的復發[25]。

目前,TERT啟動子區域突變檢測的方法有多種，主要包括Sanger測序和熒光定量PCR，均需要較昂貴的儀器設備，在基層醫院普及具有一定困難。金磁微粒免疫層析檢測已經成熟應用于基因分型的臨床檢測中，如葉酸多態性檢測[26-27]。金磁微粒檢測板包括加樣區、 地高辛單抗-金磁微粒區、檢測線(包被鏈霉親和素)、質控線(包被地高辛二抗)。其檢測原理為PCR設計時兩端的引物分別帶有生物素和地高辛標記，當受檢測的DNA中包含陽性模板時，可以擴增出同時帶有生物素和地高辛單抗的產物。此PCR產物加至檢測板加樣區后，根據薄層層析的原理向前泳動，達到地高辛單抗-金磁微粒區后，PCR產物上的地高辛與地高辛單抗結合，進而使PCR產物上攜帶金磁微粒，繼續泳動，達到檢測線后，PCR產物上的生物素與此處包被的鏈霉親和素結合，因此處可顯示出金磁微粒的顏色，過量的金磁微粒進一步達到質控線停留顯色。與此相反，當受檢測DNA中不包含陽性模板時，則檢測線處無顏色，質控線處有顏色。本文基于此檢測原理，首先設計標記引物，建立尿液TERT啟動子區域C228T和C250T突變的等位基因特異性PCR方法，然后利用金磁微粒免疫層析進行快速檢測，并對膀胱癌患者尿液進行初步驗證，最終構建了TERT啟動子區域的突變檢測方法，為后續開發臨床檢驗試劑盒提供方法學基礎。當然，本文初步建立的檢測方法還存在一定的缺陷，首先，使用的尿液量較大；其次，PCR循環數較多，導致用時較長。因此，后續需要對尿液DNA提取，以及等位基因特異性PCR的擴增效率進行優化，使檢測方法更加靈敏。

綜上所述，本文建立了一種尿液樣本TERT啟動子區域C228T和C250T突變檢測方法，此方法無需熒光定量PCR儀，操作簡單，可視化結果解讀快速、方便，便于基層推廣應用。由于TERT啟動子區域突變狀態與膀胱癌患者的預后密切相關，本文研究結果為膀胱癌患者TERT啟動子區域突變無創檢測試劑盒的開發提供了方法學參考。