miR-212在老年前列腺癌患者中的表達及其對癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的影響機制研究*

鄭 博，劉 欣，鄔宇龍，陳進渠，許麗明△

1.廈門市第五醫(yī)院泌尿外科，福建廈門 361000；2.廈門醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院放射影像科，福建廈門 361000

前列腺癌是男性最常見的高異質(zhì)性腫瘤，隨著腫瘤細胞的增殖和浸潤易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。據(jù)報道，約70%前列腺癌患者可發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[1]。該病的高異質(zhì)性給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)，對患者短期生存率有較大影響。學者根據(jù)其異質(zhì)性確定了前列腺癌患者不同基因組變化及其介導的不同信號通路，許多因子在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中發(fā)現(xiàn)其表達、分布及功能的改變，多為轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、Snail、catenin、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等[2-3]。最新研究顯示，EMT通路參與細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種細胞行為學過程[4]，且前列癌細胞不表達Snail、catenin等情況下仍能發(fā)生EMT，提示在前列腺癌復雜的生物學行為中可能存在其他更為特異性的調(diào)控機制。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼單鏈的高度保守RNA，為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，其與多種惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系已有較多報道[5-6]。miR-212是近年發(fā)現(xiàn)的miRNA家族中的一個重要分子，具有較強特異度和靈敏度，考慮可能通過介導EMT信號通路參與前列腺癌生物學行為。本文主要探討miR-212在老年前列腺癌患者中的表達及其對癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的影響機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標本、細胞株 經(jīng)病理檔案室收集2017年10月至2019年10月于廈門市第五醫(yī)院行手術(shù)確診的前列腺癌患者60例的癌組織標本及配對癌旁正常組織標本為材料，術(shù)中組織液氨冷凍后放入-80 ℃保存；24株人前列腺癌PC-3細胞購自上海北諾生物科技有限公司，研究獲得廈門市第五醫(yī)院醫(yī)學倫理會批準，實驗符合癌細胞處理和使用相關(guān)規(guī)定。

1.1.2重組慢病毒轉(zhuǎn)染細胞 接種對數(shù)生長期的PC-3細胞，加DMEM培養(yǎng)液(上海輔澤商貿(mào)有限公司；含10%胎牛血清，購自鄭州九龍生物制品)，置于WJ-3-160T型CO2培養(yǎng)箱(上海新諾儀器設(shè)備有限公司)中培養(yǎng)；待細胞融合度達到70%～80%，換無血清的培養(yǎng)基同步化24 h，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書(上海恒斐生物科技有限公司)進行轉(zhuǎn)染；將24株人前列腺癌PC-3細胞分為空白組(不作任何處理)、對照組(轉(zhuǎn)染空白miR-212對照)、miR-212組(轉(zhuǎn)染miR-212 mimics)，每組各8株，轉(zhuǎn)染72 h后觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2方法

1.2.1miR-212相對表達水平檢測 PBS(Solarbio)沖洗癌細胞和癌旁正常細胞，RIPA蛋白裂解液(北京普利萊基因有限公司)裂解后取上清液，BCA試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)測定蛋白質(zhì)水平；依次上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、漂洗，加miR-212一抗(1∶500)、GAPDH一抗(1∶2 000)，4 ℃冰箱過夜；漂洗后加二抗，25 ℃搖床1 h；漂洗后用ECL發(fā)光試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)曝光、顯影。

1.2.2細胞增殖率檢測 接種對數(shù)生長期PC-3細胞制成單細胞懸液，細胞貼壁后加10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)180 min；BIOBASE-EL10B酶標儀測定吸光度(A)值，細胞增殖率(%)= (A研究組細胞/A空白組細胞)×100%。計算轉(zhuǎn)染后12、24、36、48 h的細胞增殖率。

1.2.3細胞侵襲能力檢測 Transwell小室上室中加5×108/L的PC-3細胞和60 μL基質(zhì)膠，下室中加600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h；取下室液體，4%多聚甲醛溶液(南京森貝伽生物科技有限公司)固定15 min，HE染色試劑盒染色30 min，觀察并計算穿過小室膜的平均細胞數(shù)，以此表示細胞侵襲能力。

1.2.4細胞轉(zhuǎn)移率檢測 PC-3細胞中加0.25%胰蛋白酶(廣州達暉生物技術(shù)股份有限公司)調(diào)整細胞濃度至2×108/L，接種并待細胞融合度達80%后，用槍頭沿著與皿底垂直方向劃痕；PBS緩沖液洗滌3次，加入無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，觀察細胞遷移軌跡。

1.2.5雙熒光素酶報告實驗 參照生物信息預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測miR-212和EMT結(jié)合片段，將擴增的EMT3′-UTR序列插入到含有miR-212質(zhì)粒的位點中，構(gòu)建EMT3′-UTR熒光素酶報告載體EMT-WT (野生型)及突變載體EMT-MUT(突變型)；與空白組、對照組、miR-212組共轉(zhuǎn)染至PC-3細胞，Dual-Luciferase報告基因試劑盒檢測細胞熒光活性，分析miR-212與EMT結(jié)合的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1前列腺癌組織和癌旁正常組織miR-212表達情況比較 miR-212在前列腺癌組織中呈低表達，在癌旁正常組織中呈高表達，見圖1。前列腺癌組織和癌旁正常組織中miR-212的相對表達水平分別為1.78±0.25、3.38±0.41，前列腺癌組織中miR-212的相對表達水平低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 前列腺癌組織和癌旁正常組織中miR-212表達圖(Western blot法)

2.2空白組、對照組和miR-212組PC-3細胞增殖率比較 轉(zhuǎn)染miR-212后，PC-3細胞增殖受到抑制；24、36、48 h時，miR-212組PC-3細胞增殖率低于對照組、空白組(P<0.05)，空白組和對照組PC-3細胞增殖率比較差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。見表1。

表1 空白組、對照組和miR-212組PC-3細胞在不同時間的增殖率比較

2.3空白組、對照組和miR-212組PC-3細胞侵襲能力比較 空白組、對照組PC-3細胞向器官表面靠攏，基底層可見較多偽足，形成的癌巢較大；miR-212組PC-3細胞較少，不見偽足或僅有少量偽足，未形成癌巢，見圖2。轉(zhuǎn)染miR-212后，PC-3細胞侵襲能力受到抑制；miR-212組PC-3細胞侵襲能力低于對照組、空白組(P<0.05)；空白組和對照組PC-3細胞侵襲能力比較，差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。見圖3。

注：A表示空白組，B表示對照組，C表示miR-212組。

注：與空白組比較，aP<0.05;與對照組比較，bP<0.05。

2.4空白組、對照組和miR-212組PC-3細胞轉(zhuǎn)移率比較 空白組、miR-212組PC-3細胞在劃痕48 h后逐漸愈合，劃痕變小，miR-212組PC-3細胞在劃痕48 h后未發(fā)生愈合，劃痕甚至變大，見圖4。轉(zhuǎn)染miR-212后，PC-3細胞轉(zhuǎn)移能力受到抑制；miR-212組PC-3細胞轉(zhuǎn)移率低于對照組、空白組(P<0.05)；空白組和對照組PC-3細胞轉(zhuǎn)移率比較，差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)，見圖5。

2.5miR-212和EMT轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性分析 miR-212與EMT-WT共轉(zhuǎn)染后細胞熒光活性顯著低于對照組與EMT-WT共轉(zhuǎn)染后細胞熒光活性(P<0.05);空白組與對照組比較，與EMT-WT共轉(zhuǎn)染后細胞熒光活性差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。空白組、對照組、miR-212組與EMT-MUT共轉(zhuǎn)染后細胞熒光活性差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。見圖6。

注：A表示空白組，B表示對照組，C表示miR-212組。

注：與空白組比較，aP<0.05;與對照組比較，bP<0.05。

注：與空白組比較，aP<0.05;與對照組比較，bP<0.05。

3 討 論

前列腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后可表現(xiàn)為骨骼疼痛、病理性骨折、癱瘓、行為能力降低、骨髓抑制性貧血等，直接影響患者預(yù)后和生存質(zhì)量。隨著分子治療的深入研究，目前關(guān)于前列腺癌生物學行為、細胞基礎(chǔ)、相關(guān)細胞因子及其與關(guān)鍵的細胞信號轉(zhuǎn)導通路的報道較多，最新研究認為，EMT是促進前列腺癌增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵性因素[7-8]。且EMT過程中多種細胞因子發(fā)揮重要作用，筆者認為篩選出其中特異性因子可為前列腺癌的防治提供新的治療靶點。miR-212自發(fā)現(xiàn)以來已被證實可參與多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程。DING等[9]研究顯示，miR-212在胰腺癌組織中低表達，且低表達miR-212組侵襲能力更高。李耀輝等[10]研究指出，高表達miR-212可促進膀胱癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲過程。SHA等[11]的體外實驗結(jié)果顯示，miR-212在肝癌細胞中低表達，可調(diào)節(jié)腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境的相互作用。miR-212在前列腺癌中低表達，上調(diào)miR-212表達可抑制癌細胞血管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且預(yù)示著該病預(yù)后較好[12]。本文前列腺癌組織中miR-212呈低表達，與上述研究一致。本文采用CCK-8法檢測不同時間對前列腺癌PC-3細胞增殖的影響，結(jié)果顯示出，過表達miR-212可有效抑制癌細胞生長增殖，提示miR-212在參與前列腺癌病理性進展中發(fā)揮抑癌作用。根據(jù)轉(zhuǎn)染時間圖發(fā)現(xiàn)，過表達miR-212對前列腺癌細胞作用機制呈時間依賴性，時間越長，抑制效果越明顯。湯利等[13]的平板克隆實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-212細胞可明顯降低單細胞克隆形成率，達到有效抑制膀胱癌細胞增殖的作用。本文Transwell小室實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組穿過小室膜的細胞數(shù)更低，細胞轉(zhuǎn)移率也更低，表明miR-212可有效降低前列腺癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力，證實miR-212是一種可在體內(nèi)外調(diào)節(jié)腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控因子。SHKURNIKOV等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-212能擴大其他眾多癌基因轉(zhuǎn)錄，其主要通過靶向調(diào)節(jié)特異性信號蛋白通路來抑制前列腺癌的侵襲能力。本文通過雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，miR-212組與EMT-WT共轉(zhuǎn)染后的細胞熒光活性顯著低于對照組與EMT-WT共轉(zhuǎn)染后的細胞熒光活性，結(jié)合國內(nèi)外研究結(jié)果[15-16]，提示miR-212可通過靶向調(diào)節(jié)EMT信號通路影響前列腺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲能力。

miR-212在前列腺癌組織中呈低表達，過表達miR-212可通過靶向調(diào)節(jié)EMT信號通路抑制前列腺癌細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力，有望成為前列腺癌的一種新的生物治療靶點。但由于時間限制，樣本量小，且前列腺癌進展受多種因素影響，仍需設(shè)計更為嚴密的、多中心、大樣本、雙盲研究進一步分析相關(guān)生物學行為機制。