多重不對(duì)稱(chēng)PCR-電化學(xué)芯片技術(shù)檢測(cè)感染性腹瀉病原體的臨床價(jià)值*

程 強(qiáng)，周 磊，付曉蕊，徐修禮，劉家云，郝曉柯

空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710032

腹瀉是指每日排便3次或3次以上，且糞便性狀異常，如稀便、水樣便、黏液便、膿血便或血便等[1]。感染性腹瀉是指由病原微生物及其產(chǎn)物或寄生蟲(chóng)所引起的、以腹瀉為主要臨床特征的一組腸道傳染病[2]。感染性腹瀉居我國(guó)法定傳染病發(fā)病率首位，具有病原體種類(lèi)復(fù)雜、混合發(fā)病率高、發(fā)病聚集性等特征，是重要的公共衛(wèi)生事件之一。在暴發(fā)流行時(shí)，對(duì)感染性腹瀉病原體進(jìn)行快速診斷，對(duì)疫情的防控具有重要意義[3]。本研究以多重不對(duì)稱(chēng)PCR-電化學(xué)芯片技術(shù)(簡(jiǎn)稱(chēng)電化學(xué)芯片法)檢測(cè)感染性腹瀉相關(guān)病原體，與FilmArray gastrointestinal panel法(簡(jiǎn)稱(chēng)FilmArray法)、普通細(xì)菌培養(yǎng)和病毒測(cè)序方法比較，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性檢出率和一致性，探討電化學(xué)芯片法的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年10月至2019年6月本院兒科住院及門(mén)診病例標(biāo)本，患兒以嘔吐或腹瀉等消化道癥狀為主訴，24 h內(nèi)腹瀉大便次數(shù)≥3次，糞便性狀異常的腹瀉患兒新鮮糞便標(biāo)本。本研究采取患兒自愿原則，獲得患兒及家屬的知情同意。

1.2儀器與試劑 DA910電化學(xué)基因傳感器檢測(cè)系統(tǒng)、Smart 32全自動(dòng)核酸提取儀購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司；FilmArray全自動(dòng)PCR分析系統(tǒng)購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃股份有限公司。核酸提取或純化試劑(磁珠法)、腹瀉病原體檢測(cè)試劑盒(電化學(xué)芯片法)購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司；FilmArray gastrointestinal panel購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。選擇性培養(yǎng)基(SS平板)；顯色培養(yǎng)基(弧菌顯色培養(yǎng)基、大腸顯色培養(yǎng)基)。沙門(mén)菌診斷用血清；副溶血弧菌診斷用血清。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3方法 取就診時(shí)腹瀉患兒新鮮糞便標(biāo)本，立即放入Copan轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基中送檢。以普通細(xì)菌培養(yǎng)和病毒測(cè)序結(jié)果作為診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。普通細(xì)菌培養(yǎng)：取新鮮待測(cè)標(biāo)本立即接種于大腸顯色培養(yǎng)基、弧菌顯色培養(yǎng)基、沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基、TCBS平板、XLD平板、SS平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱孵育16～24 h，同時(shí)接種3%氯化鈉堿性蛋白胨水、改良亞硒酸鹽磺綠增菌肉湯增菌培養(yǎng)后，挑取可疑菌落轉(zhuǎn)種至三糖鐵瓊脂等培養(yǎng)基，進(jìn)一步進(jìn)行腸道致病菌生化試驗(yàn)、血清型分型試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果依據(jù)每年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)M100-S23標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。病毒測(cè)序：待測(cè)標(biāo)本采用冰壺加冰或泡沫箱加冰密封送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。電化學(xué)芯片法：使用Smart 32全自動(dòng)核酸提取儀或純化試劑(磁珠法)進(jìn)行待測(cè)標(biāo)本的核酸提取、純化、擴(kuò)增、雜交等，之后使用腹瀉病原體檢測(cè)試劑盒，針對(duì)17種常見(jiàn)的腹瀉相關(guān)病原體設(shè)計(jì)特異性引物和探針，探針包括捕獲探針和信號(hào)探針。捕獲探針?lè)謩e固定在特制的印刷電路板金電極表面，制備成腹瀉電化學(xué)傳感器(芯片)，用于捕獲PCR多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物；信號(hào)探針與已捕獲的PCR產(chǎn)物特異結(jié)合。由于信號(hào)探針標(biāo)記有二茂鐵分子，通過(guò)夾心雜交產(chǎn)生電流的變化，應(yīng)用電化學(xué)基因傳感器檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)出電流值(信號(hào)值)，最后對(duì)17種病原體檢測(cè)信息進(jìn)行判定。試劑盒中的陰性質(zhì)控品參與提取，用于對(duì)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控； C-FX 陽(yáng)性質(zhì)控品參與提取，用于 PCR 檢測(cè)試劑的質(zhì)控。FilmArray法：將待測(cè)標(biāo)本根據(jù)規(guī)定條件加樣，使用FilmArray gastrointestinal panel和分析系統(tǒng)檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)菌株：致瀉性大腸埃希菌、腸炎沙門(mén)菌、副溶血性弧菌、福氏志賀菌等均來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以率表示，電化學(xué)芯片法、FilmArray法與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法結(jié)果比較，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。電化學(xué)芯片法、FilmArray法與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法結(jié)果的一致性使用Kappa一致性檢驗(yàn)進(jìn)行分析，Kappa>0.4表示具有一致性。

2 結(jié) 果

2.1研究對(duì)象人群特征及不同方法病原檢出情況 隨機(jī)選取102例感染性腹瀉患兒，年齡1～15歲，男性54例，女性48例，以普通細(xì)菌培養(yǎng)和病毒測(cè)序結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，使用3種不同方法對(duì)102例腹瀉標(biāo)本進(jìn)行腸道病原體檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。“金標(biāo)準(zhǔn)”方法共82例標(biāo)本呈陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為80.39%，共檢出病毒102株，細(xì)菌18株。電化學(xué)芯片法檢測(cè)出78例標(biāo)本呈陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為76.47%，共檢出病毒81株，細(xì)菌15株。FilmArray法檢測(cè)出86例標(biāo)本呈陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為84.31%，共檢出病毒111株，細(xì)菌32株。3種方法同時(shí)檢出最多的腹瀉相關(guān)病原體為輪狀病毒A群。

表1 3種方法對(duì)102例感染性腹瀉標(biāo)本病原體檢出情況

2.2電化學(xué)芯片法和FilmArray法分別與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法檢測(cè)結(jié)果比較 以“金標(biāo)準(zhǔn)”方法作為對(duì)照，分別與電化學(xué)芯片法和FilmArray法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。電化學(xué)芯片法與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法比較，靈敏度為90.24%，特異度為80.00%，2種方法檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=44.092，P<0.05)。FilmArray法與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法比較，靈敏度為97.56%，特異度為70.00%，2種方法檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=55.490，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 電化學(xué)芯片法和FilmArray法分別與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法結(jié)果比較

2.3電化學(xué)芯片法和FilmArray法分別與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法一致性比較 以“金標(biāo)準(zhǔn)”方法作為對(duì)照，分別與電化學(xué)芯片法和FilmArray法進(jìn)行一致性比較并進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)。電化學(xué)芯片法與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法比較，檢測(cè)結(jié)果完全和部分一致的標(biāo)本有90例，不一致的標(biāo)本有12例，一致率為88.24%，進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，Kappa值為0.653，2種方法在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有較好的一致性。FilmArray法與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法比較，檢測(cè)結(jié)果完全和部分一致的標(biāo)本有94例，不一致的標(biāo)本有8例，一致率為92.16%，進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，Kappa值為0.731，2種方法在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有較好的一致性。見(jiàn)表3。

表3 電化學(xué)芯片法和FilmArray法分別與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法一致性比較

續(xù)表3 電化學(xué)芯片法和FilmArray法分別與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法一致性比較

3 討 論

通過(guò)對(duì)本院兒科門(mén)診腹瀉患兒新鮮糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，“金標(biāo)準(zhǔn)”方法的陽(yáng)性檢出率為80.39%，感染性腹瀉以輪狀病毒感染為主，且混合感染發(fā)病率高，與張輝等[4]調(diào)查研究基本一致。“金標(biāo)準(zhǔn)”方法發(fā)現(xiàn)20例諾如病毒感染患兒，占比較高，應(yīng)引起注意。諾如病毒感染后，極易在同齡兒童聚集地，如學(xué)校引起暴發(fā)流行[5-6]。細(xì)菌性病原體以致病性大腸埃希菌為主，未發(fā)現(xiàn)沙門(mén)菌，與以往報(bào)道有差別[7]，可能與采集標(biāo)本時(shí)間、地點(diǎn)、標(biāo)本量有關(guān)。未發(fā)現(xiàn)志賀菌和霍亂弧菌等引起法定傳染病的致病菌，且在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，采用普通細(xì)菌培養(yǎng)方法診斷感染性腹瀉致病菌的陽(yáng)性檢出率低于FilmArray法[8-9]。在感染性腹瀉的診斷中，分子診斷技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法的良好補(bǔ)充。

在檢測(cè)腹瀉患兒標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用FilmArray法檢測(cè)準(zhǔn)確率高，與國(guó)外報(bào)道一致，標(biāo)本周轉(zhuǎn)時(shí)間2.0 h左右，耗時(shí)短，僅需一步手工加樣，操作簡(jiǎn)單[10-11]，但此方法每臺(tái)儀器只能檢測(cè)1例患兒標(biāo)本，通量嚴(yán)重不足，單標(biāo)本檢測(cè)費(fèi)用較高[12]，患兒家庭負(fù)擔(dān)較重，目前在國(guó)內(nèi)不適合開(kāi)展大規(guī)模診斷。電化學(xué)芯片法與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法結(jié)果比較，靈敏度為90.24%，特異度為80.00%，一致率為88.24%，檢測(cè)結(jié)果整體情況較好。電化學(xué)芯片法發(fā)現(xiàn)多重感染性腹瀉病原體能力不如FilmArray法[13-14]，標(biāo)本周轉(zhuǎn)時(shí)間約為5.5 h，多于FilmArray法，但是少于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法[15]，可同時(shí)檢測(cè)32例患兒標(biāo)本，通量高，手工操作步驟少，在一定程度上降低人為操作誤差，人員經(jīng)簡(jiǎn)單培訓(xùn)，即可進(jìn)行檢測(cè)，便于開(kāi)展，且標(biāo)本檢測(cè)成本較FilmArray法大幅降低。

電化學(xué)芯片法檢測(cè)結(jié)果與其他方法比較時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了一些問(wèn)題。(1)整體陽(yáng)性檢出率為76.47%，還需要進(jìn)一步提高；(2)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率還需要進(jìn)一步提高；(3)在混合感染中，該方法的鑒別能力不足，應(yīng)繼續(xù)優(yōu)化試劑成分，以達(dá)到更好的效果。

總之，多重不對(duì)稱(chēng)PCR-電化學(xué)芯片技術(shù)，系統(tǒng)靈敏度、特異度較好，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。