習慣性流產患者血清ENO1Ab、ACA、Tim-1的水平及意義

李紹武，李志霞，肖 華，卓 芬，黃娟娟

海南省第三人民醫院檢驗科，海南三亞 572000

習慣性流產(RSA)是臨床常見的早期妊娠并發癥，以下腹疼痛、陰道出血為常見臨床癥狀，嚴重威脅女性患者身心健康[1-2]。目前，RSA發病機制雖尚未完全明確，但研究者認為其發病與環境、內分泌失調、遺傳缺陷、炎性反應、免疫功能異常等相關[3-4]。相關文獻報道，抗α-烯醇化酶(ENO1)抗體(ENO1Ab)在不明原因的RSA患者血清中水平升高，可能是不明原因RSA的自身免疫生物標志物[5]。另有研究顯示，抗心磷脂抗體(ACA)在RSA患者血清中呈高水平，經黃體酮聯合孕康口服液治療后，其水平降低，因此，ACA可能參與并影響RSA的發病過程[6]。此外，T細胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-1(Tim-1)在RSA患者血清中水平升高，經淋巴細胞免疫療法成功治療后，其水平下降，Tim-1可能與RSA的病理進展有關[7]。本研究通過檢測ENO1Ab、ACA、Tim-1在RSA患者血清中的水平，分析三者的臨床意義，以期為臨床早期診治RSA提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年2月至2019年12月本院診治的RSA患者124例為RSA組，患者年齡22～34歲，平均(28.08±2.29)歲；孕周4～12周，平均(8.76±2.54)周。選擇同期本院129例體檢健康的早孕女性為健康對照組，其中年齡23～35歲，平均(27.96±3.22)歲；孕周5～12周，平均(8.62±2.43)周。2組年齡、孕周比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。收集2組年齡、收縮壓、舒張壓、文化程度、職業、生殖道感染、孕期被動吸煙等一般資料。

RSA患者納入標準：(1)患者妊娠孕周為4～12周；(2)有RSA史。健康對照組納入標準：(1)既往未出現死胎、死產，無RSA史；(2)此次妊娠期間生命體征無任何異常；(3)經B超檢查胚胎發育健康；(4)無病毒感染史、婦科疾病史。RSA組、健康對照組排除標準：(1)合并精神異常；(2)合并免疫系統疾病、內分泌系統疾病、心腦血管疾病、遺傳性疾病；(3)合并嚴重心、肝、腎等重要器官功能障礙。所有孕婦自愿參與本研究，均簽署知情同意書，且本研究所用方法符合倫理學要求，經本院倫理委員會批準后開展實施。

1.2儀器與試劑 Trizol Reagent(貨號：J44580)購自上海金穗生物科技有限公司，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis試劑盒(貨號：69001-3)購自北京泰澤嘉業科技發展有限公司；SYBR Green master mix(貨號：203401)購自上海浩洋生物科技有限公司。重組人 ENO1蛋白試劑盒(貨號：11554-H07E-100)購自上海江萊生物科技有限公司，人ACA酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：CSB-E04977h-1)購自上海恒斐生物科技有限公司，人白細胞介素(IL)-2 ELISA試劑盒(貨號：QN-PS0055)購自上海喬羽生物科技有限公司，IL-4 ELISA試劑盒(貨號：111010)購自廣州蕊特生物科技有限公司。紫外分光光度計(型號：DU-730)購自上海普迪生物技術有限公司，ABI 7500Fast實時熒光定量PCR(qPCR)儀(型號：ABI 7500Fast )購自北京安麥格貿易有限公司，酶標儀(型號：AMR-100)購自杭州奧盛儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1標本收集 收集所有受試者清晨空腹外周血5～6 mL于真空采血管中，室溫靜置35 min，4 ℃以4 200 r/min離心8 min，留取上層血清，分裝于無菌EP管中，保存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.3.2qPCR檢測血清Tim-1水平 于-80 ℃冰箱中取出適量凍存血清標本，解凍，以Trizol法提取標本總RNA，參照反轉錄Revert Aid First Strand cDNA Synthesis試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA。根據SYBR Green master mix擴增反應試劑盒說明書將PCR擴增、定量檢測。反應體系總體積為20 μL：Premix 10 μL，cDNA 2.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.8 μL，ddH2O 4.0 μL，F/R各1.6 μL。反應條件設置：97 ℃預熱8 min；95 ℃變性20 s，64 ℃退火25 s，40個循環。Tim-1以GAPDH為內參，Tim-1上游引物序列為5′-GAA CAT TAG TCT ACT GAC GGC CAA TAC-3′，下游引物序列為5′-GAA CCT CCT TTT TGA AGA AAT ACT TTT T-3′；GAPDH上游引物序列為5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3′，下游引物序列為5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′。以2-ΔΔCT法計算Tim-1水平。

1.3.3ELISA檢測血清ENO1Ab、ACA、IL-2、IL-4水平 按照血清ENO1Ab、ACA、IL-2、IL-4 ELISA試劑盒說明書配制不同水平的標準樣品，利用酶標儀檢測不同水平標準品在450 nm處的吸光度(A)值，繪制各指標的標準回歸曲線。取適量凍存血清標本，解凍，檢測標本在450 nm處的A值，根據標準回歸曲線計算血清ENO1Ab、ACA、IL-2、IL-4水平。

2 結 果

2.12組一般資料比較 與健康對照組比較，RSA組患者生殖道感染、孕期被動吸煙比例升高，差異有統計學意義(P<0.05)。2組年齡、收縮壓、舒張壓、文化程度、職業比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組一般資料比較

2.22組血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平比較 與健康對照組比較，RSA組患者血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平比較

2.32組血清IL-2、IL-4水平比較 與健康對照組相比，RSA組患者血清IL-2水平明顯升高，IL-4水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組血清IL-2、IL-4水平比較

2.4RSA患者血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平與IL-2、IL-4水平的關系 Pearson相關分析結果顯示，RSA患者血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平與IL-2水平呈正相關(P<0.05)，與IL-4水平呈負相關(P<0.05)。見表4。

表4 RSA患者血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平與IL-2、IL-4水平的相關性

2.5RSA患者血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平間的關系 Pearson相關分析結果顯示，RSA患者血清ENO1Ab、ACA水平與Tim-1水平呈正相關(r=0.467、0.465，P<0.05)，ENO1Ab水平與ACA水平無明顯相關性(r=0.119，P>0.05)。見圖1。

注：A表示 RSA患者血清ENO1Ab水平與Tim-1水平的關系；B表示RSA患者血清ACA水平與Tim-1水平的關系；C表示RSA患者血清ENO1Ab水平與ACA水平的關系。

2.6RSA發生的影響因素分析 以是否發生RSA為因變量，以生殖道感染、孕期被動吸煙、ENO1Ab、ACA、Tim-1、IL-2、IL-4水平為自變量，進行Logistic回歸分析，結果顯示，生殖道感染、高ENO1Ab、ACA、Tim-1、IL-2水平是影響RSA的危險因素(P<0.05)，高IL-4水平是影響RSA的保護因素(P<0.05)。見表5。

表5 RSA發生的Logistic回歸分析結果

3 討 論

ENO1是一種糖酵解酶，其可調控能量代謝，與免疫類疾病關系密切[8]。有關研究顯示，ENO1可作為自身抗原誘導自身免疫反應，可增加自身免疫甲狀腺炎女性發生流產的風險[9]。另有研究表明，自身免疫甲狀腺炎患者血清ENO1Ab水平明顯增加，ENO1Ab可能在自身免疫甲狀腺炎免疫反應過程中起重要作用[10]。以上研究表明，ENO1或ENO1Ab水平異常可能與免疫功能異常類疾病有關。本研究中RSA組患者血清ENO1Ab水平明顯高于健康對照組，與以往研究一致[3]，提示ENO1Ab可能在RSA疾病進程中起重要作用，推測ENO1Ab通過影響免疫反應，進而影響RSA的發生、發展。

ACA是一組自身抗體，其可增加血栓素水平，影響前列腺素生成，引起母體及胎盤發生血管痙攣和供血不足，促進血栓形成；同時，ACA可與胎盤血管相應受體結合，引起蛻膜血管變化，從而導致胎盤栓塞。另外，ACA可刺激血小板聚集，血栓形成加劇，促使胎盤病變加重，進而引起胎盤或胎兒缺血缺氧，從而導致流產[11]。ACA在原因不明ACA患者中水平較高，經中西醫結合治療后，其水平降低，ACA可能在不明原因RSA中發揮重要作用。本研究中RSA組患者血清ACA水平明顯升高，其可能參與并影響RSA病理發展過程。究其原因，ACA可能通過影響胎盤血氧供應等進而在RSA中發揮一定作用。

Tim-1是Tim家族重要成員之一，可與其配體發生特異性結合，進而調控T淋巴細胞增殖、分化，促進細胞因子分泌，激發Th2型免疫應答，進而影響Th1/Th2平衡，與自身免疫病的免疫應答關系密切[12]。相關研究資料顯示，Tim-1在系統性紅斑狼瘡患者血清中高表達，經人免疫球蛋白和醋酸潑尼松聯合治療后，其水平明顯下降，Tim-1可能在系統性紅斑狼瘡疾病發展中有重要作用[13]。另有研究顯示，Tim-1在原發性膽汁性肝硬化中表達上調，其可作為診治原發性膽汁性肝硬化的潛在靶標[14]。以上研究證明，異常表達的Tim-1可能影響免疫類疾病發病進程。本研究中Tim-1在RSA組患者血清中水平升高，與以往研究一致[5]，提示Tim-1可能在RSA的發生、發展中起一定作用，推測Tim-1通過影響炎性因子釋放及Th2型免疫應答，進而影響RSA的病理發展。

既往研究顯示，T淋巴細胞亞群比例失衡是影響流產的重要因素[15]。Th1/Th2細胞因子變化與RSA密切相關，機體Th2型細胞因子較多時有助于維持健康妊娠，但機體Th1型細胞因子較多時可能引發流產[16]。有關研究顯示，IL-2、IL-4分別是由Th1、Th2型細胞分泌的主要細胞因子，RSA患者血清中IL-2水平升高，IL-4水平降低，IL-2、IL-4可能在RSA的免疫反應中起重要作用[17]。本研究中RSA組患者血清IL-2水平明顯高于健康對照組，IL-4水平明顯低于健康對照組，與劉文亞等[17]研究一致，提示IL-2、IL-4可能通過影響機體免疫反應過程，進而參與RSA的發病進程。本研究顯示，RSA患者血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平與IL-2水平呈正相關，與IL-4水平呈負相關，提示ENO1Ab、ACA、Tim-1可能與IL-2、IL-4相互作用，進而共同影響RSA的發展過程。進一步研究顯示，RSA患者血清ENO1Ab、ACA水平與Tim-1水平呈正相關，提示ENO1Ab、ACA可能與Tim-1相互作用，從而共同影響RSA的發展，但具體影響機制仍需深入研究。研究發現，生殖道感染、高ENO1Ab、ACA、Tim-1、IL-2水平是影響RSA的危險因素，高IL-4水平是影響RSA的保護因素，及時監控血清ENO1Ab、ACA、Tim-1、IL-2、IL-4水平及生殖道感染狀況，有助于早期診治RSA。但本研究樣本較少，可能會導致結果出現一定偏差，后續試驗將擴大樣本量進行深入研究。