檸檬酸鈉對腎缺血再灌注損傷模型小鼠腎損傷指標及炎癥細胞因子的影響①

汪 泉 劉 紅 (武漢市中西醫結合醫院暨湖北省武漢市第一醫院，武漢 430022)

腎缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是一種由適應性免疫和固有免疫共同介導的炎癥疾病[1]。IRI的發病機制與細胞凋亡、炎癥、壞死、氧化應激等有關，但確切的機制仍不清楚。據報道，由免疫失調引起的炎癥可導致腎功能衰竭患者的死亡率顯著升高[2]。IRI常見于創傷、休克、移植、腎切除等方面。雖然缺血后再灌注通常有助于恢復由缺血引起的器官功能障礙，但在某些情況下，再灌注可加劇與缺血相關的損傷。最近的研究表明，腎病患者的炎癥細胞因子如IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β等與病情進展密切相關[3]。上述細胞因子主要由Th17和Treg細胞分泌并調節腎功能衰竭中的免疫激活，但其具體機制及藥物干擾作用仍不明確[4]。檸檬酸鈉也稱枸櫞酸鈉，是人體的主要中間代謝產物，在代謝和其他細胞過程中起著重要作用。檸檬酸鈉結合鈣并抑制鈣晶體的成核和生長[5]。一項動物實驗報道，檸檬酸鈉可改善小鼠的腎損傷[6]。目前，檸檬酸鈉通常被用作慢性腎衰竭患者血液透析中的抗凝血劑，并且用檸檬酸鈉抗凝透析液可以抑制慢性腎衰竭患者的免疫功能障礙[7]。然而，檸檬酸鈉在IRI方面的作用仍不明確。本研究建立了IRI小鼠模型，用不同劑量的檸檬酸鈉處理IRI模型小鼠，以期探討檸檬酸鈉對IRI小鼠的腎損傷指標及炎癥細胞因子的影響及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級健康雄性C57BL/6小鼠購自徐州醫學院實驗動物中心，共40只，8～10周齡。隨機分為4組：假手術組(Sham)、模型組(Model)、低劑量組(Low dose)和高劑量組(High dose)，每組10只。所有小鼠在22～24℃實驗室中適應性飼養1周，光照條件為12-12 h光-暗循環，其間提供標準小鼠食物。本研究已獲得動物護理和使用委員會批準。

1.1.2試劑 將檸檬酸鈉(陜西圣瑞醫藥科技有限公司)；IL-6、IL-17、IL-10和TGF-β ELISA試劑盒(美國R&D公司)；中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NAGL)ELISA試劑盒(Bioporto Diagnostics公司)；大鼠CD4+分離試劑盒、CD4+CD25+Treg細胞分離試劑盒(德國美天旎生物技術有限公司)；抗IFN-γ(2 μg/ml)、抗IL-4(2 μg/ml)、轉化生長因子-β(TGF-β，2 ng/ml)、IL-23(20 ng/ml)和IL-6(20 ng/ml)(美國eBioscience公司);MTT(Sigma)。

1.2方法

1.2.1IRI小鼠模型的建立 用50 mg/kg戊巴比妥鈉腹膜內麻醉小鼠。于小鼠腹正中做2 cm切口，充分暴露雙側腎蒂，無創動脈夾夾閉雙側腎蒂，可見小鼠腎臟從鮮紅色逐漸變為紫黑色，缺血30 min左右時松開動脈夾恢復灌注，小鼠腎臟由暗紅色變為鮮紅色表明建模成功，絲線縫合切口。假手術組小鼠僅暴露雙側腎臟后關閉切口，不進行缺血再灌注程序。術后所有小鼠自由攝水和食物。

1.2.2檸檬酸鈉處理 將檸檬酸鈉溶解在蒸餾水中，術前7 d每天對小鼠進行檸檬酸鈉溶液灌胃，低劑量組小鼠按照200 mg/kg的劑量對小鼠進行灌胃，高劑量組小鼠按照600 mg/kg的劑量對小鼠進行灌胃。假手術組和模型組小鼠灌胃等體積蒸餾水。

1.2.3樣品收集 在實驗結束時，將小鼠單獨放置在代謝籠中，從每只小鼠的心臟收集血樣用于測試血尿素氮(BUN)和血清肌酸酐(Scr)。在各組小鼠給藥24 h后對所有動物實施安樂死，將小鼠腎臟快速取出并置于4℃冰箱保存。

1.2.4組織病理檢查 將各組小鼠一部分腎組織固定在4%多聚甲醛中，石蠟包埋，并切成2～3 μm切片。然后用HE染色，光學顯微鏡下觀察各組小鼠的腎臟組織病理學變化。

1.2.5ELISA測定 按照說明書，采用IL-6、IL-17、IL-10和TGF-β ELISA試劑盒測定各腎組織樣品中細胞因子濃度。用ELISA試劑盒測定血液樣本中NAGL的濃度。實驗結束后，使用Microplate Reader測定450 nm處光密度(OD)，并根據標準品計算樣品濃度。

1.2.6細胞分離 為分離Treg和Th17細胞，將小鼠脾臟切成碎片并研磨，過200目鋼篩。將脾臟在4℃下2 000 r/min離心，PBS洗滌3次。然后加入小鼠淋巴細胞分離培養基，并將混合物以2 000 r/min離心30 min。樣品用PBS洗滌3次并制備脾細胞懸液。使用大鼠CD4+CD25+Treg細胞分離試劑盒按照制造商說明從脾細胞中分離出Treg細胞，流式細胞儀進行分析。使用大鼠CD4+分離試劑盒分離CD4+T細胞。分離的CD4+T細胞在Th17細胞極化條件下刺激3 d，如下：抗IFN-γ(2 μg/ml)、抗IL-4(2 μg/ml)、轉化生長因子-β(TGF-β，2 ng/ml)、IL-23(20 ng/ml)和IL-6(20 ng/ml)。使用流式細胞儀檢測分離的Th17細胞。該細胞分離方法不會破壞細胞活性。

1.2.7細胞活力測定 通過MTT測定法評估Treg和Th17細胞的生長和活力。將分離的細胞加入含有10% MTT的生長培養基中，并將細胞接種在96孔板中，于37℃、5%CO2環境中過夜培養。DMSO溶解甲瓚晶體，并在490 nm處測定OD值。

2 結果

2.1檸檬酸鈉可顯著抑制IRI小鼠BUN、Scr和NGAL表達 如圖1所示，與假手術組相比，模型組小鼠的血漿BUN和Scr水平顯著升高，表示小鼠發生IRI，而檸檬酸鈉預處理可明顯抑制BUN和Scr水平的升高。另外，與低劑量檸檬酸鈉處理組相比，高劑量組小鼠血漿BUN和Scr水平顯著降低。模型組小鼠血漿NGAL含量顯著升高，而經檸檬酸鈉預處理后顯著降低。

2.2檸檬酸鈉對小鼠組織病理改變的影響 HE染色結果顯示，假手術組小鼠的腎組織形態正常，腎小管上皮細胞結構清晰，腎間質無充血水腫(圖2)。模型組小鼠的腎組織損傷明顯加重，腎小管上皮細胞腫脹,空泡變性，腎小管管腔明顯擴張和阻塞，腎間質充血水腫，出現炎癥細胞浸潤。而經低劑量和高劑量的檸檬酸鈉處理后，腎小管管腔擴張情況明顯改善，腎間質出血水腫情況減少，炎癥細胞浸潤明顯減輕，上皮細胞空泡、脫落情況減少。

圖1 不同組小鼠血漿BUN、Scr和NGAL濃度Fig.1 Concentrations of blood BUN，Scr，and NGAL in different groups of miceNote:The different letters "a，b，c，d" indicate significant differences between groups (P<0.05)，the same below.

圖2 各組小鼠腎臟組織病理變化(HE染色)Fig.2 Histopathological changes of kidneys of mice in each group (HE staining)

2.3檸檬酸對IRI小鼠炎癥細胞因子的影響 ELISA法檢測小鼠腎組織的IL-6和IL-17水平，結果顯示：模型組小鼠IL-6和IL-17水平顯著高于假手術組，檸檬酸鈉處理后顯著降低(圖3)。ELISA法檢測細胞因子IL-10和TGF-β的水平，結果顯示，與假手術組相比，模型組小鼠IL-10和TGF-β的水平顯著降低，而檸檬酸鈉預處理后其水平明顯升高(圖4)。

2.4檸檬酸鈉顯著降低IRI小鼠Th17細胞并增強Treg細胞活力 MTT法檢測不同組小鼠Th17和Treg細胞的活力， 結果表明： 與假手術組相比，模型組小鼠Th17細胞的存活率顯著提高，檸檬酸鈉預處理顯著降低Th17細胞存活率(圖5)。另外，與低劑量治療組相比，高劑量檸檬酸鈉對Th17細胞的存活率具有更大的抑制作用。然而，模型組小鼠的Treg細胞活力顯著降低，而檸檬酸鈉預處理可以劑量依賴方式提高Treg存活率。

圖3 不同組小鼠腎組織中IL-6和IL-17的表達水平Fig.3 Expression levels of IL-6 and IL-17 in kidney tissues of different groups of mice

圖4 不同組小鼠腎組織中TGF-β和IL-10的表達水平Fig.4 Expression levels of TGF-β and IL-10 in kidney tissues of different groups of mice

圖5 MTT法測定不同組小鼠Th17和Treg細胞的活力Fig.5 MTT assay for Th17 and Treg cell viability in different groups of mice

3 討論

免疫失調參與急慢性腎損傷等多種疾病的發生發展，CD4+T細胞是適應性免疫系統中最重要的因素，其在宿主防御和免疫穩態維持中至關重要[8]。CD4+T細胞可分化成一系列細胞亞群，包括Th1、Th2、Th17和Treg細胞等[9]。其他研究顯示，Th17和Treg細胞活力及其細胞因子的分泌在IRI患者中異常，并且與各種腎臟疾病的進展密切相關[10]。檸檬酸鈉通常用作抗凝劑來糾正血液透析中血液或尿液的pH值，既往研究表明，檸檬酸鈉對慢性腎病有積極的治療作用，檸檬酸鈉抗凝可抑制慢性腎衰竭患者的免疫功能障礙[7]。本研究探討了檸檬酸鈉對IRI模型小鼠腎損傷指標及炎癥細胞因子的影響及其作用機制。既往研究顯示，BUN和Scr水平在腎衰竭及其他腎臟疾病中明顯升高[11]。本研究中觀察到了相同的結果，表明模型組小鼠腎損害程度明顯提高。此外，檸檬酸鈉處理以劑量依賴性方式降低了BUN和Scr的水平，表明檸檬酸鈉可能具有改善腎損傷的作用。據報道，NGAL是一種腎小管損傷標志物，通常是急性腎功能衰竭的敏感標志物，并且其水平在IRI患者中明顯提高[12-13]。本研究發現，NGAL的含量在模型組中顯著增加，在檸檬酸鈉預處理組中顯著降低，表明檸檬酸鈉預處理可有效緩解小鼠的腎功能障礙。

Th17和Treg細胞都與自身免疫疾病和炎癥進展有關。Th17和Treg細胞之間的平衡影響疾病的進展。如果平衡從Treg細胞向Th17細胞移動，即Th17/Treg細胞比率升高，則疾病的嚴重程度會顯著升高。Th17細胞通過分泌IL-6和IL-17而發揮促炎作用[14]。而Treg細胞通過分泌TGF-β和IL-10在抑制炎癥過程中起關鍵作用[15]。本研究結果顯示，檸檬酸鈉預處理顯著抑制腎組織中Th17細胞因子IL-6和IL-17的水平。并且，與模型組小鼠相比，檸檬酸鈉預處理可顯著升高Treg細胞因子IL-10和TGF-β的表達水平。這些結果進一步證實檸檬酸鈉可調節IRI小鼠中Th17和Treg的細胞因子表達。

Th17細胞在炎癥和組織損傷中發揮重要作用，并參與腎炎、腎小球腎炎和其他腎臟疾病的發生發展[16]。而Treg細胞是一類控制體內自身免疫反應性的T細胞亞群，具有預防多種腎病的作用[17]。本研究中，模型組小鼠Th17細胞活力顯著增強，而經檸檬酸鈉預處理則可顯著降低Th17細胞活力。模型組小鼠Treg細胞活力顯著降低，檸檬酸預處理則可顯著提高Treg細胞活力。 這些發現證實Th17和Treg細胞的失調與腎損傷程度一致，并且可以通過檸檬酸鈉預處理來緩解小鼠的腎損傷。

總之，本研究表明檸檬酸鈉通過抑制Th17細胞因子IL-6和IL-17的水平并升高Treg細胞因子IL-10和TGF-β水平來抑制炎癥反應，并通過降低Th17細胞并增加Treg細胞活力來緩解小鼠腎缺血再灌注損傷，并且其改善作用呈劑量依賴性方式。因此，檸檬酸鈉有望成為腎缺血再灌注損傷等相關腎臟疾病治療的候選藥物。