蒼術提取物通過調控miR-378c影響IL-1β誘導的骨關節炎軟骨細胞增殖和凋亡①

蒲博強 邢曉偉 郭 祥

(中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院骨科，海口 570208)

骨關節炎是一種常見的退行性骨關節疾病，其病理特點表現為關節軟骨變性、破壞，關節邊緣與軟骨下骨反應性增生等。隨著年齡的增長，骨關節炎的患病率升高，嚴重影響中老年患者的生命健康及生活質量[1]。骨關節炎的發病機制尚不明確，研究顯示，軟骨細胞的異常增殖和凋亡在骨關節炎的發生發展中起重要作用，抑制軟骨細胞的凋亡是治療骨關節炎的一種途徑[2-3]。蒼術是一種多年生草本植物，其根狀莖可入藥。研究顯示，蒼術提取物具有增強免疫、改善心臟功能、止痛、抗腫瘤等多種功效[4-5]，但其是否可影響軟骨細胞的增殖和凋亡尚未闡明。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小分子單鏈非編碼RNA，長度約為18～25個核苷酸，參與調控細胞的增殖、凋亡等生物學行為，在疾病的發生發展中起重要作用[6-8]。荊琳等[9]研究顯示，miR-378c在骨關節炎組織中高表達，可能是膝骨關節炎發病的潛在致病基因。目前，miR-378c對軟骨細胞的增殖和凋亡的影響尚未闡明。本研究通過體外分離培養軟骨細胞，探討蒼術提取物對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖、凋亡的影響及其是否通過調控miR-378c表達發揮作用，以期為骨關節炎的藥物研發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本來源 選取6例原發性膝骨關節炎患者行全膝人工關節置換術廢棄的退變關節軟骨標本，男2例，女4例，年齡61～76歲，平均年齡(72.39±3.57)歲。原發性膝骨關節炎診斷標準依據中華醫學會骨科學分會骨關節炎診斷指南。本研究經本院病理委員會批準同意，患者自愿簽署知情同意書。

1.1.2實驗試劑 蒼術飲片購自武漢市九州通醫藥有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、DMEM培養基和BCA蛋白測定試劑盒購自北京索萊寶公司；四甲基噻唑藍(methylthiazoletrazolium，MTT)和胰蛋白酶購自美國Sigma公司；LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；miR-144-3p模擬物(mimics)及模擬陰性對照物、miR-378c抑制劑及陰性對照序列購自上海吉瑪制藥有限公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒購自美國Fermentas公司；PCR引物購自上海生工生物工程有限公司；鼠抗人細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)多克隆抗體購自美國Abcam公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1蒼術提取物的制備 蒼術飲片干燥后粉碎，過40目篩，加3倍量蒸餾水，60℃回流2次，每次2 h。合并濾液，減壓濃縮至含生藥量1.0 g/ml，4℃儲存備用，使用時培養基稀釋至所需濃度。

1.2.2軟骨細胞分離培養 參照文獻[10]方法分離培養軟骨細胞。生理鹽水沖洗手術取下的軟骨標本，低溫無菌保存。在1 h內用含1%雙抗的預冷PBS緩沖液清洗3次。首先用手術刀片薄層削棄關節面外層軟骨組織，除去增生骨贅表面的薄層纖維軟骨。然后薄層削取關節中心區域的軟骨薄片并避開軟骨下骨組織，用含1%雙抗的PBS清洗軟骨薄片，手術剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，然后用0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min。吸棄胰蛋白酶，用0.2%二型膠原酶37℃恒溫水浴消化18 h，1 500 r/min 離心10 min。棄上清，加入含10%FBS的DMEM培養基混懸，過200目篩，將細胞懸液用含10%FBS的DMEM培養基接種于細胞培養瓶中，置于37℃、5%CO2、97%濕度的培養箱中培養。7 d后更換培養基，此后每2～3 d更換1次新鮮的培養基。待細胞融合至80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養。

1.2.3細胞轉染 取對數生長期的軟骨細胞，以每孔1×105個細胞接種于6孔細胞培養板，待細胞融合至60%時，參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明書，分別轉染miR-378c、anti-miR-NC、miR-378c mimics及miR-NC。轉染后6 h，更換新鮮培養基，繼續再培養至24 h，收集細胞用于后續實驗。

1.2.4MTT檢測細胞增殖 將未轉染、轉染anti-miR-378c、anti-miR-NC、miR-378c mimics及miR-NC細胞均以5×103個/孔接種于96孔板，培養4 h后，棄培養基，分組處理。未轉染的軟骨細胞分為對照組：常規培養基正常培養；IL-1β組：用含10 ng/ml IL-1β的培養基分別作用軟骨細胞24、48、72 h；IL-1β+蒼術提取物-L、IL-1β+蒼術提取物-M和IL-1β+蒼術提取物-H組：用含10 ng/ml的IL-1β分別與5、10、15 μg/ml的蒼術提取物共同作用軟骨細胞24、48、72 h。轉染anti-miR-378c、anti-miR-NC的細胞均用含10 ng/ml IL-1β的培養基作用48 h，記為IL-1β+anti-miR-378c組和IL-1β+anti-miR-NC組。轉染miR-378c mimics、miR-NC組細胞均用含10 ng/ml IL-1β與15 μg/ml蒼術提取物共同作用24、48、72 h，記為IL-1β+蒼術提取物-H+miR-378c組和IL-1β+蒼術提取物-H+miR-NC組。每組設3個復孔。培養結束后，每孔加20 μl濃度為5 g/L的MTT，孵育4 h。棄培養基，加150 μl二甲基亞砜，振蕩混勻后，于酶標儀490 nm處測定光密度(optical density，OD)值。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 將未轉染、轉染anti-miR-378c、anti-miR-NC、miR-378c mimics及miR-NC細胞均以5.0×104個/孔接種于24孔板，培養4 h后棄培養基，細胞分組同1.2.4，各組細胞均培養48 h。取出細胞培養板，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，加入PBS清洗細胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書操作，取1.0×106個細胞，加入400 μl結合緩沖液，用移液器輕輕吹打混懸細胞。加入10 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后，室溫避光孵育15 min。再加入5 μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)，輕輕混勻后，室溫避光孵育 5 min。最后再加入100 μl結合緩沖液，混勻后上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6實時熒光定量PCR檢測miR-378c表達 采用Trizol試劑提取細胞中總RNA，經微量核酸儀檢測RNA的純度和濃度后，參照逆轉錄試劑盒操作說明書，逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行擴增。引物序列：miR-378c F：5′-GCACCGGTTAGCCGATTGCCG-3′，R：5′-TTGGCGGGTTAAGGCCGCA-AT-3′；U6 F：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCG-3′，R：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′。擴增程序為95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環。以U6為內參，2-ΔΔCt法計算miR-378c相對表達水平。

1.2.7Western blot法檢測蛋白表達 采用RIPA裂解液裂解細胞，置于冰上充分裂解30 min，裂解后，12 000 r/min離心10 min，上清液即為提取總蛋白。參照BCA蛋白測定試劑盒操作說明書測定蛋白濃度。取適量蛋白溶液于EP管中，密封后置于沸水中煮沸5 min。取出，冷卻至室溫，進行SDS-PAGE凝膠電泳，30 μg/孔。電泳結束后，轉至PVDF膜，并于5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別加入CyclinD1(稀釋度1∶800)、P21(稀釋度1∶400)、Bcl-2(稀釋度1∶600)和Bax(稀釋度1∶1 000)抗體，4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜后，加入辣根過氧化酶標記的二抗IgG(稀釋度1∶200)，37℃孵育1 h。TBST洗膜后，加入化學發光試劑ECL，避光顯影。

2 結果

2.1蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞增殖的影響 與對照組相比，IL-1β組RPOC細胞活性和CyclinD1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，P21蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與IL-1β組相比，IL-1β+蒼術提取物-L組、IL-1β+蒼術提取物-M組和IL-1β+蒼術提取物-H組RPOC細胞活性和CyclinD1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，P21蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。選用15 μg/ml的蒼術提取物作用48 h進行后續實驗。見圖1和表1、2。

2.2蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞凋亡的影響 與對照組相比，IL-1β組RPOC細胞凋亡率和Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。與IL-1β組相比，IL-1β+蒼術提取物-H組RPOC細胞凋亡率和Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖2、表3。

圖1 蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞CyclinD1、P21蛋白表達的影響Fig.1 Effect of Rhizoma Atractylodis extract on express-ion of CyclinD1 and P21 proteins in IL-1 β-induced RPOC cells

表1 蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞增殖的影響

2.3蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞中miR-378c表達的影響 與對照組相比，IL-1β組RPOC細胞miR-378c表達水平顯著升高(P<0.05)。與IL-1β組相比，IL-1β+蒼術提取物-H組RPOC細胞miR-378c表達水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

2.4抑制miR-378c表達對IL-1β作用的RPOC細胞增殖、凋亡的作用 與IL-1β+anti-miR-NC組相比，IL-1β+anti-miR-378c組RPOC細胞活性、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，miR-378c表達水平、細胞凋亡率、P21和Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖3、表5、6。

2.5過表達miR-378c可逆轉蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞增殖的促進作用 與IL-1β + 蒼術提取物-H+miR-NC組相比，IL-1β+蒼術提取物-H+miR-378c組RPOC細胞活性和CyclinD1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-378c水平和P21蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖4、表7。

表2 蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞中CyclinD1、P21蛋白表達的影響

圖2 蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of Rhizoma Atractylodis extracton apoptosis of IL-1β-induced RPOC cellsNote:A.Effect of Rhizoma Atractylodis extracton on apoptosis of IL-1β-induced RPOC cells;B.Effect of Rhizoma Atractylodis extracton on expressions of Bax and Bcl-2 protein in IL-1β-induced RPOC cells.

2.6過表達miR-378c可逆轉蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞凋亡的抑制作用 與IL-1β+蒼術提取物-H+miR-NC組相比，IL-1β+蒼術提取物-H+miR-378c組RPOC細胞Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率和Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見表8、圖5。

表3 蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞凋亡的影響

表4 蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞中miR-378c表達的影響

圖3 抑制miR-378c表達對IL-1β作用的RPOC細胞增殖、凋亡蛋白表達的影響Fig.3 Effect of inhibiting miR-378c on proliferation and expressions of apoptotic related proteins of IL-1β-induced RPOC cells

表5 抑制miR-378c表達對IL-1β作用的RPOC細胞增殖的影響

圖4 過表達miR-378c逆轉蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞增殖蛋白表達的影響Fig.4 Overexpression of miR-378c reversed effect of Rhizoma Atractylodis extract on expressions of proliferation proteins of IL-1β-induced RPOC cells

表6 抑制miR-378c表達對IL-1β作用的RPOC細胞凋亡的影響

表7 過表達miR-378c逆轉蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞增殖的影響

表8 過表達miR-378c可逆轉蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞凋亡的影響

圖5 過表達miR-378c可逆轉蒼術提取物對IL-1β作用的RPOC細胞凋亡蛋白表達的影響Fig.5 Overexpression of miR-378c reversed effect of Rhizoma Atractylodis extract on expressions of apoptotic proteins of IL-1β-induced RPOC cells

3 討論

骨關節炎的發生發展與多種因素有關，如年齡、外傷、軟骨組織新陳代謝失衡等。軟骨細胞是關節軟骨中唯一存在的細胞，近年來研究顯示，軟骨細胞的異常增殖和凋亡在骨關節炎的發生發展中起重要作用[11]。IL-1β是一種致炎細胞因子，可誘導軟骨細胞凋亡，在骨關節炎病變過程中破壞軟骨細胞的代謝平衡，可作為誘導骨關節炎體外模型的炎癥因子[12-13]。本研究顯示，IL-1β誘導軟骨細胞后，細胞增殖能力降低，凋亡加劇，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達降低，P21和Bax蛋白表達升高，與相關研究報道結果一致[14-15]。

蒼術具有抗炎、抗腫瘤和免疫調節的作用，由黃柏、蒼術、牛膝、薏苡仁組成的四妙丸對膝關節骨性關節炎具有較好的治療效果[16-17]。目前，蒼術提取物對軟骨細胞增殖和凋亡的影響還未知。本研究顯示，蒼術提取物干預后，IL-1β誘導的軟骨細胞增殖活性升高，凋亡降低，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達上調，P21和Bax蛋白表達降低，提示蒼術提取物可促進IL-1β誘導的軟骨細胞增殖，并抑制細胞凋亡，具有成為治療骨關節炎藥物的潛在價值。

miRNA在真核生物體內廣泛存在，參與調控軟骨細胞的增殖和凋亡。如李坤等[18]研究顯示，miR-543在骨關節炎模型大鼠軟骨組織中表達下調，過表達miR-543可促進IL-1β誘導的軟骨細胞增殖，降低TNF-α、IL-6等炎癥因子表達。miR-378c是近年新發現的一種miRNA，參與腫瘤等疾病的發生發展[19]。GUNGORMEZ等[20]研究發現，miR-378c在結腸癌組織中表達下調，上調miR-378c可抑制結腸癌細胞的增殖，并促進細胞凋亡，可作為結直腸癌早期診斷的生物標志物。ZHANG等[21]研究顯示，骨關節炎患者軟骨干細胞中miR-378c表達差異與骨關節炎發展進程相關。目前，miR-378c對骨關節炎軟骨細胞增殖和凋亡的影響還未知。本研究顯示，IL-1β誘導后，軟骨細胞中miR-378c表達水平升高，提示miR-378c參與骨關節炎發生發展。通過轉染miR-378c抑制劑至軟骨細胞抑制miR-378c表達后，IL-1β誘導的軟骨細胞增殖能力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達水平升高，細胞凋亡率及P21和Bax蛋白表達水平降低，說明抑制miR-378c表達可促進IL-1β誘導的軟骨細胞增殖，并抑制細胞凋亡，提示miR-378c可能是骨關節炎治療的潛在分子靶點。本研究還顯示，蒼術提取物可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞miR-378c表達，且過表達miR-378c逆轉了蒼術提取物對IL-1β誘導的RPOC細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響，提示蒼術提取物與下調細胞miR-378c表達均可促進IL-1β誘導的軟骨細胞增殖，抑制細胞凋亡。

綜上所述，蒼術提取物可促進IL-1β誘導的軟骨細胞增殖，并抑制細胞凋亡，其可能與下調細胞中miR-378c表達有關。