Treg、Breg、DCs PD-L1表達水平與膿毒癥患兒病情嚴重程度及生存情況的關系

于 航 朝魯門其其格

(內蒙古醫科大學附屬醫院兒童重癥監護室,呼和浩特 010020)

膿毒癥是由感染導致的一種全身失控性炎癥和多器官功能障礙綜合征，重癥患者常因缺血缺氧和組織灌注不足引發膿毒性休克[1]。膿毒癥起病急且患者預后不良，嚴重可危及生命，若并發急性肺損傷死亡率可高達60%以上。及早對膿毒癥患者病情程度及預后進行有效評估并進行針對性治療可有效改善患者預后，提高患者生存率[2]。膿毒癥的發生發展過程涉及炎癥反應、感染、免疫及組織損傷等生理病理改變，主要機制是機體感染及免疫抑制導致機體免疫功能障礙[3]。樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)屬于抗原呈遞細胞，具有激活免疫細胞和活化初始T細胞的作用，可啟動免疫應答和誘導免疫耐受，但膿毒癥患者是否存在 DCs異常分化以及是否影響T細胞功能需進一步研究[4]。調節性B淋巴細胞(regulatory B lymphocytes，Breg)及調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)作為與免疫應答顯著相關的淋巴細胞可調控機體免疫活性[5-6]。兩者在免疫相關性疾病如系統性紅斑狼瘡、銀屑病、類風濕關節炎患者體內均異常表達，推測其可能與膿毒癥發生發展密切相關。本研究檢測并比較不同病情嚴重程度的膿毒癥患者Treg、Breg、DCs PD-L1表達水平，并探討其與患者預后生存率的關系，旨在為膿毒癥診斷、治療及預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選取60例膿毒血癥入院患者及同期108例健康體檢者作為研究對象，依據急性生理和慢性健康狀況評分系統(A-PACHEⅡ)按照膿毒癥患者病情嚴重程度分為中輕度膿毒癥組38例(A-PACHEⅡ評分≤20分)和嚴重膿毒癥組(A-PACHEⅡ評分>20分)22例[7]。男性35例，女性25例，年齡7～15歲，平均年齡(11.28±1.41)歲。原發疾病主要包括：肺部感染25例、急性胰腺炎9例、急性腹膜炎8例、多發損傷11例、心肺復蘇綜合征7例；所有患者治療7 d后根據患者生存情況分為存活組46例和死亡組14例。健康對照組男性62例，女性46例，年齡8～14歲，平均年齡(11.19±1.25)歲。兩組研究對象性別、年齡、BMI指數等一般資料差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者知情同意。納入標準：①所有患者均符合美國胸科醫師協會/危重病醫學會(ACCP/SCCM)關于膿毒癥的診斷標準[8]；②所有研究對象入組前均未接受免疫抑制劑、抗感染藥物、糖皮質激素等治療。排除標準：①伴有病毒性肝炎、HIV病毒感染、自身免疫性疾病、惡性腫瘤或免疫缺陷者；②近期使用過免疫抑制劑、抗感染藥物、糖皮質激素等治療者；③臨床資料不完整或隨訪失訪者。

1.1.2儀器與試劑 流式細胞儀(型號：Attune NxT，賽默飛世爾)；Lin-1-FITC、CD33-PE、PD-L1-APC 抗體、抗人CD38(APC標記)、抗人CD20(FITC標記)、抗人CD24(PE標記)(Abcam中國)。

1.2方法

1.2.1Treg、Breg、DCs PD-L1表達水平檢測 分別取健康志愿者及膿毒癥患者靜脈血5 ml于肝素抗凝管，流式細胞術檢測Treg及DCs比例，以及血清Treg、Breg、DCs PD-L1表達。DCs表型測定時依次加入Lin-1-FITC、CD33-PE、PD-L1-APC 抗體3 μl，混勻后室溫避光孵育30 min，離心，洗滌，采用設門法標記Lin-CD33+PD-L1+DCs，以平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI) 為單位計算DCs Lin-CD33+PD-L1+表達水平。CD20+CD24hiCD38hiBreg水平測定時分別加入抗人CD38(APC標記)、抗人CD20(FITC標記)、抗人CD24(PE標記)，室溫避光孵育20 min，離心、洗滌并采用2%多聚甲醛溶液固定，流式細胞術檢測Breg占比。以相同方法檢測外周血CD4+CD25+CD127lowTreg水平。

2 結果

2.1不同危重程度患者Treg、Breg及DCs PD-L1表達 中輕度膿毒癥患者及嚴重膿毒癥患者Treg、DCs PD-L1表達水平均顯著高于健康對照組(P<0.001)，Breg水平顯著低于健康對照組(P<0.001)，且嚴重膿毒癥患者上述細胞水平與中輕度膿毒癥患者差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

2.2不同危重程度患者A-PACHEⅡ評分與死亡率比較 中輕度和嚴重膿毒癥組患者的A-PACHEⅡ評分見表2，嚴重膿毒癥組患者7 d死亡率顯著高于中輕度膿毒癥組(P<0.05)。

2.3不同預后患者Treg、Breg、DCs PD-L1表達與A-PACHEⅡ評分比較及相關性分析 不同預后患者Treg、Breg、DCs PD-L1表達及A-PACHEⅡ評分差異顯著(P<0.05)，死亡組患者Treg、DCs PD-L1表達及A-PACHEⅡ評分均顯著高于存活組，Breg水平顯著低于存活組(P<0.001)；Treg、DCs PD-L1表達與A-PACHEⅡ評分呈顯著正相關(r=0.885、0.854，P<0.05)，Breg水平與A-PACHEⅡ評分呈顯著負相關(r=-0.892，P<0.05)，見表3。

2.4Treg、Breg、DCs水平、A-PACHEⅡ評分對膿毒癥患者預后診斷的價值 Treg、Breg、DCs PD-L1表達及A-PACHⅡ評分檢測診斷膿毒癥患者預后的ROC曲線見圖1，診斷效能均較高。Treg水平預測預后的ROC AUC為0.896(95%CI：0.748～0.952)，最佳截斷值為4.15%，靈敏度、特異度分別為 80.00%、67.50%；Breg水平預測預后的ROC AUC為0.954(95%CI：0.823～0.987)，最佳截斷值為1.36%，靈敏度、特異度分別為 87.50%、80.00%；DCs PD-L1表達水平預測預后的ROC AUC為0.923(95%CI：0.785～0.968)，最佳截斷值為423.56 MFI，靈敏度、特異度分別為 85.00%、70.00%；A-PACHEⅡ評分預測預后的ROC AUC為0.856(95%CI：0.652～0.923)，最佳截斷值為19.87分，靈敏度、特異度分別為75.00%、71.67%。

表1 各組Treg、Breg、DCs PD-L1表達

圖1 流式細胞術檢測CD4+CD25+CD127lowTreg表達Fig.1 Flow cytometry detection of CD4+CD25+CD127lowTreg expression

表2 不同危重程度患者A-PACHEⅡ評分與死亡率例(%)]

表3 不同預后患者Treg、Breg、DCs PD-L1表達和A-PACHEⅡ評分比較及其相關性分析

圖2 ROC曲線分析Fig.2 ROC curve analysis

3 討論

膿毒癥是一種可導致患者死亡的危急重癥，死亡原因主要是感染導致多器官衰竭，其中炎癥反應及免疫抑制是膿毒癥過程的2種重要病理狀態[9]。DCs作為一種與免疫抑制相關的重要免疫細胞，其異常表達與膿毒癥患者預后不良甚至死亡密切相關，從而導致DCs抗原提呈及T淋巴細胞增殖活化被抑制，最終引發免疫抑制。DCregs作為DCs 的亞群，可誘導Treg產生[10]。ELKE等[11]研究DCregs可通過產生TGF-β、IL-10等負性調控因子對T 細胞活化過程產生明顯抑制作用，誘導Treg失活。Lin-CD33+PD-L1+是DCs的重要表型，與膿毒癥免疫抑制密切相關。本研究顯示，膿毒癥患者Lin-CD33+PD-L1+表達比健康志愿者明顯升高，說明PD-1水平上升可導致DCs數減少，進一步導致患者免疫功能抑制。而PD-1/PD-L1作為與免疫抑制相關受體及配體，Treg免疫功能的發揮與PD-1/ PD-L1信號通路有重要聯系。機體免疫細胞接受免疫刺激后，為阻止T細胞過度激活，CD4+/CD8+細胞表面大量表達PD-1[12]。HOOGENDIJK等[13]研究證實初始 CD4+T細胞在PD-L1的誘導刺激下轉為Treg，當PD-L1表達上升后進一步誘導Treg免疫抑制。同時PD-1/PD-L1信號通路具有抑制T細胞的作用，進一步產生反向調節及免疫抑制。因此在膿毒癥發生發展過程中，PD-1/PD-L1通路的反向免疫調節功能在誘導Treg分化中發揮重要作用，從而參與膿毒癥免疫抑制過程，膿毒癥患者體內CD4+/CD8+T 細胞亞群占比明顯低于健康志愿者，其會進一步誘導Treg分化，引發免疫抑制。

CD4+CD25+Treg可明顯抑制T細胞免疫功能，屬于抑制性T細胞亞群，主要抑制CD4+/CD8+T 細胞增殖和活化。王秋卉等[14]研究認為低表達CD127的Treg與膿毒癥發生發展相關。本文在其研究基礎上發現膿毒癥患者CD4+CD25+CD127lowTreg水平顯著高于健康對照組，且重度膿毒癥患者高表達程度更高(P<0.05)，說明膿毒癥患者免疫功能發生抑制，提示可將CD4+CD25+CD127lowTreg細胞比例作為評價膿毒癥嚴重程度的重要指標。CD20+CD24hiCD38hiBreg是B淋巴細胞的重要表型，其表達水平與機體免疫耐受顯著相關，其免疫耐受能力的產生主要由于Breg可通過分泌發現，TGF-β及IL-10調節機體免疫應答[15]。研究證實Breg在不同疾病中的表達存在差異，如系統性硬化癥患者Breg表達顯著降低的同時也會發生表型及功能損傷，且B 淋巴細胞受體受到刺激后抑制P38Mark/STAT3 通路激活[16]。連廣琬[17]等研究發現類風濕關節炎患者的CD24hiCD38hiBreg水平顯著低于健康志愿者，認為Breg可能通過抑制免疫作用參與免疫性及炎癥反應性疾病發生發展。本研究顯示，膿毒癥患者Breg表達水平與疾病嚴重程度呈負相關。

APACHEⅡ評分是評價患者病情嚴重程度的經典指標，廣泛適用于各類危重患者。研究證實APACHEⅡ評分與重癥患者的死亡風險呈顯著正相關[18]。本研究顯示，死亡組患者Treg、DCs PD-L1表達水平及A-PACHEⅡ評分均顯著高于存活組，Breg水平顯著低于存活組(P<0.001)；Treg水平及DCs PD-L1表達水平與A-PACHEⅡ評分呈顯著正相關(r=0.885、0.854，P<0.05)，Breg水平與A-PACHEⅡ評分呈顯著負相關(r=-0.892，P<0.05)。提示Treg、Breg水平及DCs PD-L1表達水平可作為評估膿毒癥患者預后的有效指標。通過ROC曲線進一步分析患者外周血3種細胞水平預后預測的診斷效能，診斷效能均較高(AUC分別為0.896、0.954、0.923)。提示通過檢測膿毒癥患者Treg、Breg及DCs PD-L1水平可有效評估患者病情嚴重程度，可將其作為預后預測的重要指標，為膿毒癥的臨床診治提供新的靶點和思路。