細胞外核苷酸對免疫細胞的調節作用①

王秋吉 楊啟鑫 柴艷敏 單春華

(東北林業大學生命科學學院，哈爾濱 150040)

核苷酸是核酸的組成成分，隨著核酸分布于生物體內各器官、組織、細胞核及胞質中，參與生物體的遺傳、發育、生長等基本生命活動。核苷酸不僅在細胞內具有重要作用，在細胞外空間同樣發揮重要作用。一定條件下細胞會主動釋放核苷酸到胞外空間，或在組織受損時泄露到胞外空間，這類核苷酸稱為胞外核苷酸[1]。胞外核苷酸的濃度由定位于細胞膜的磷酸水解酶調節。不同濃度的胞外核苷酸，特別是胞外三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)與不同的嘌呤受體相互作用調節多種生理和病理過程，是廣泛調節神經系統、血液系統、免疫系統等功能的重要信號[2]。免疫細胞也會主動釋放ATP，且幾乎所有免疫細胞都表達嘌呤受體。胞外ATP在炎癥、凋亡或壞死等條件下濃度升高，作為危險相關模式分子調節免疫細胞功能，發揮二次信號作用[3]。胞外ATP可以有效調節巨噬細胞、樹突狀細胞(dentritic cells,DCs)、中性粒細胞、酸性粒細胞、淋巴細胞等免疫細胞的生理功能，與細胞遷移、趨化性、細胞因子釋放、細胞成熟、細胞毒性等過程相關[4]。

1 胞外核苷酸的釋放及濃度調節

胞外核苷酸的釋放有主動釋放和被動釋放兩種方式。主動釋放受多種因素調節，通過胞吐作用和質膜通道完成，而被動釋放不受控制，是由細胞膜破裂造成的。

細胞受到刺激活化或發生凋亡時，可通過胞吐作用主動釋放ATP，如神經元細胞、血小板、淋巴細胞、肥大細胞、內皮細胞等將ATP儲存在細胞囊泡中，囊泡與細胞膜融合將內容物釋放到胞外空間，通過胞吐作用主動釋放ATP[5]。細胞也可以通過離子通道和孔道兩種質膜通道主動釋放ATP[6]。離子通道蛋白主要有大離子通道蛋白和體積調節型離子通道蛋白。內皮細胞、胎盤細胞及多種免疫細胞在滲透性腫脹和缺氧期間通過大離子通道蛋白主動釋放ATP，受到滲透性腫脹刺激后，內皮細胞和巨噬細胞也通過體積調節型離子通道主動釋放ATP。參與細胞主動釋放ATP的孔道蛋白有泛素和連接蛋白兩種。免疫細胞在受到缺氧或細胞凋亡的刺激時，會通過泛素主動釋放ATP[6]。而細胞膜去極化、胞外Ca2+濃度降低和促炎因子刺激時，可誘導血管平滑肌和內皮細胞等通過定位于非質膜連接區域的連接蛋白通道主動釋放ATP。同一細胞可以同時通過多種途徑主動釋放ATP[6]。而細胞壞死時，由于細胞膜破裂，細胞內部的DNA、RNA等泄露到胞外空間，被水解為胞外核苷酸。

釋放于胞外的核苷酸濃度受酶調節，參與胞外核苷酸和核苷濃度調節的酶主要有堿性磷酸酶、胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶家族(ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase，e-NTPDases)、堿性磷酸酶和5′-外核苷酸酶(ecto-50-nucleotidase，NT5E/CD73)、外核苷酸焦磷酸酶(ecto-nucleotide pyrophosphatases，ENPPs)、腺苷脫氨酶、NAD糖水解酶、CD38/NADase、二核苷酸聚磷酸水解酶、腺苷酸激酶、核苷二磷酸激酶和潛在的胞外-F1-fo ATP合成酶[7]。e-NTPDases、堿性磷酸酶和CD73主要調節胞外ATP的濃度[7]。 e-NTPDases中主要發揮作用的是NTPDases 1、2、3和 8。 NTPDase1也稱為CD39在各種淋巴細胞和靜息血管內皮上表達。CD39和堿性磷酸酶具有同樣的功能，可以將胞外ATP水解為ADP和AMP。CD73進一步將AMP水解成腺苷，腺苷通過腺苷脫氨酶降解為肌苷或通過核苷轉運蛋白轉運到細胞內[6]。ENPPs也是代謝胞外核苷酸的重要水解酶，可以水解ATP、GTP、UTP和CTP生成對應核苷以及磷酸和焦磷酸，也可以水解UDP-sugars生成UMP和sugar-1P，還可以水解煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、ADP核糖和二核苷酸多磷酸鹽[7]。

2 胞外核苷酸受體

胞外核苷酸與不同的嘌呤受體(purines receptors,P受體)結合，啟動不同的信號轉導途徑。P受體包括2個家族：識別腺苷的P1受體和主要識別ATP、ADP、UTP和UDP 的P2受體[4]。

P1受體是G蛋白偶聯受體，有4個亞型分別是高親和力受體A1、A2A和低親和力受體A2B、 A3。P1受體有腺苷酸環化酶活性，調節環狀AMP(cyclic AMP，cAMP)。A2A和A2B激活腺苷酸環化酶，而A1和A3抑制腺苷酸環化酶。中性粒細胞、單核細胞/巨噬細胞、T細胞等多種免疫細胞表達P1受體，影響cAMP的生成[3]。

P2受體有配體門控離子通道型受體(P2X受體) 和G 蛋白偶聯型受體(P2Y受體)2種類型。P2X受體是以ATP為唯一配體的質膜通道，介導細胞中多種陽離子的流入或流出如Na+、K+、Ca2+，在人類和嚙齒動物中共有7種亞型P2X1～P2X7。P2X受體以三聚體的方式排列在離子通道周圍，與3個ATP結合打開離子通道，誘導絲裂原活化蛋白激酶途徑等的激活[3]。P2Y受體以ATP、ADP、UTP、UDP和UDP-sugars為配體(表1)，激活后可以調節腺苷酸環化酶磷脂酶C和離子通道等信號傳導途徑，有8種亞型：P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11、P2Y12、P2Y13和P2Y14[4]。

3 胞外核苷酸對免疫細胞功能的調節

不同的胞外核苷酸與特定免疫細胞表達的不同受體結合發揮不同作用。胞外ATP與巨噬細胞的P2X受體相互作用，調節巨噬細胞分泌細胞因子或增強吞噬作用。胞外核苷酸對DCs功能的調節受濃度和刺激時間的影響。胞外ATP對中性粒細胞及嗜酸性粒細胞的趨化性和遷移具有調節作用。胞外ATP對自然殺傷(natural killer,NK)細胞和T細胞的活性及穩定性具有調節作用。

3.1胞外核苷酸對巨噬細胞的調節 巨噬細胞具有攝取處理外來物質和壞死細胞的吞噬功能，同時還可以產生多種細胞因子參與抗原呈遞和免疫調節。胞外ATP可以刺激巨噬細胞分泌多種細胞因子或增強其吞噬作用以適應外部微環境的改變。

胞外ATP與巨噬細胞上的P2X7受體結合使K+外流，觸發NLRP3(natch domain-,leucine-richrepeat-,PYD-containing protein 3，NLRP3)炎癥小

表1 P2Y受體及其配體

體聚集[8]，NLRP3炎癥小體促進半胱氨酸蛋白酶1前體成為有活性的半胱氨酸蛋白酶1，將IL-1β前體和IL-18前體轉化為活性細胞因子[9]。敲除小鼠巨噬細胞表面的P2X7受體，NLRP3炎癥小體、IL-1β和IL-18分泌減少[10]。胞外ATP通過與P2X7受體相互作用也可以刺激巨噬細胞產生活性氧，激活胞外調節蛋白激酶和半胱氨酸蛋白酶1，加工IL-1β前體和IL-18前體[11]。此外毫摩爾濃度的胞外ATP還可以刺激巨噬細胞產生IL-1α、IL-6、TNF-α[4]。低摩爾濃度的胞外ATP與P2Y11受體相互作用，通過依賴于cAMP的蛋白激酶A或由cAMP直接激活的交換蛋白直接或間接增加cAMP負向調節反應，抑制炎癥細胞因子產生并同時上調抗炎細胞因子IL-10的表達[12]。細胞凋亡時釋放少量的胞外核苷酸與巨噬細胞的P2X1受體或P2X3受體相互作用，上調整合素1和波連蛋白受體在巨噬細胞中的表達，增強巨噬細胞與凋亡小體的結合能力，從而增強巨噬細胞的吞噬作用[13]。而細胞壞死時泄露的大量胞外核苷酸只刺激巨噬細胞的促炎活性不增強其吞噬作用。抑制胞外ATP與巨噬細胞的嘌呤受體結合，可顯著降低HIV病毒的復制率[3]。

3.2胞外核苷酸對DCs的調節 樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是激活T細胞最有效的抗原呈遞細胞。DCs的激活是啟動先天免疫的關鍵環節。不同濃度胞外核苷酸及不同刺激持續時間對DCs的影響是不同的，低濃度的胞外ATP促進DCs成熟并遷移到淋巴結，刺激T細胞分化。高濃度胞外ATP增強DCs的促炎活性。其他胞外核苷酸也可以調節DCs的功能[4]。

低濃度的胞外ATP慢性刺激可促進DCs成熟，增強募集Th2細胞的能力，引發2型免疫應答。胞外ATP與其他刺激DCs成熟的因子如細菌內毒素、脂多糖等共同存在時，IL-1b、IL-1a、IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子-α的表達受到抑制，IL-1受體拮抗劑和IL-10的表達不受影響，從而增強T輔助細胞的分化能力[14]。胞外ATP也會影響DCs趨化因子受體的表達。胞外ATP與DCs相互作用下調炎癥趨化因子如CC趨化因子受體5的受體，上調淋巴趨化因子如CXC趨化因子受體4和CC趨化因子受體7[15]。淋巴趨化因子的上調有利于淋巴結定位及增強DCs與T細胞相互作用的能力。此外胞外ATP也影響DCs分泌趨化因子。胞外ATP促進DCs分泌淋巴趨化因子CCL22，抑制磷酸酯多糖刺激的炎癥趨化因子CXCL10和CCL5的分泌[15]。趨化因子釋放的轉變有利于Th2的募集。因此長期低濃度胞外ATP對DCs，的成熟具有較強的調節活性，通過增強DCs在淋巴結中的定位能力和募集Th2細胞，從而啟動2型免疫反應。高濃度胞外ATP和細菌病原體共同刺激DCs，胞外ATP加速IL-1b前體的成熟，顯著提高DCs的促炎活性[16]。

胞外UDP通過抑制脂多糖誘導的核因子-κB 的激活，抑制 DCs 的成熟及分泌IL-12、IL-23，從而抑制了DCs 介導的 Th1 和 Th17 細胞的分化，緩解自身免疫性疾病[17]。胞外ADP抑制DCs的成熟和吞噬功能，UTP促進DCs釋放細胞因子[18]。

3.3胞外核酸對的中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的調節 中性粒細胞是高速運動的吞噬細胞，可以快速從血液循環中遷移，負責入侵微生物的初始清除，是先天性免疫重要的效應細胞。胞外核苷酸對中性粒細胞細胞遷移、分泌細胞因子、凋亡及吞噬功能具有調節作用。在炎癥細胞應激/損傷/死亡血小板聚集刺激下產生的N-甲酰基肽激活中性粒細胞表面的甲酰肽受體，使中性粒細胞通過泛素連接蛋白1或連接蛋白43釋放ATP[18]。這一部分胞外ATP與其他細胞釋放的胞外ATP共同作用于中性粒細胞表面的P2Y2受體，打開Ca2+通道聚集肌動蛋白，促進中性粒細胞向損傷部位遷移。同時作為受到脂多糖刺激的Toll樣受體的第二階段反應，刺激中性粒細胞分泌IL-8，分泌的IL-8反過來誘導其他中性粒細胞的趨化性[19]。胞外ATP也會作用于中性粒細胞表面的P2Y11受體延長細胞凋亡周期[20]。胞外ATP和ADP激活巨噬細胞表面分子，刺激中性粒細胞的吞噬作用，也會在病原體刺激之前抑制中性粒細胞的吞噬功能[21]。這種抑制作用在抑制噬血細胞綜合征等病理條件下發生的過度吞噬作用有重要意義。

嗜酸性細胞是粒細胞白細胞，可以從循環中募集到炎癥區域，調節免疫反應。嗜酸性粒細胞可以由尿酸鈉晶體誘導釋放自分泌ATP，這些自分泌胞外ATP作為正反饋信號與嗜酸性粒細胞上的P2受體相互作用。胞外ATP調節嗜酸性粒細胞分泌細胞因子及其趨化性和遷移。胞外UTP和ADP以濃度依賴性的方式誘導嗜酸性粒細胞快速、短暫地聚合肌動蛋白，調節嗜酸性粒細胞向炎癥組織遷移[22]。胞外ATP與人嗜酸性粒細胞表達的P2Y2受體結合，釋放嗜酸性粒細胞陽離子蛋白、IL-6、IL-8，與P2X1，P2X7和P2Y6受體相互作用釋放IL-8[4]。此外胞外ATP與內皮細胞表達的P2Y2受體相互作用可以調節嗜酸性粒細胞的趨化性。胞外ATP與定位于內皮細胞的P2Y2受體相互作用，使內皮細胞表達血管細胞黏附分子1。血管細胞黏附分子1與嗜酸性粒細胞表達的α4β1整合素結合，誘導嗜酸性粒細胞的遷移和黏附[22]。

3.4胞外核苷酸對淋巴細胞的調節 胞外ATP可以調節T輔助細胞(T helper cells，Th細胞)的增殖和CD62L的釋放。在應激信號刺激和主要組織相容性復合物Ⅱ類與T細胞受體結合的共同作用下，Th細胞通過泛素1釋放ATP。自分泌的胞外ATP與Th細胞表達的P2X1、P2X4和P2X7受體作用，調節IL-2的分泌和Th細胞的增殖[23]。胞外ATP與P2X7受體集合還可以促進Th細胞釋放CD62L[4]。CD62L的釋放與T細胞活化有關[4]。

胞外ATP調節調節型T細胞的穩定性及維持免疫耐受性。IL-6促進調節型T細胞釋放ATP。自分泌的胞外ATP與調節型T細胞的P2X7受體結合，促進調節型T細胞分化為分泌IL-17的Th17細胞[24]。主要組織相容性復合物Ⅱ類與調節型T細胞的T受體結合后，上調特異性轉錄因子Foxp3，增強了CD39的表達，促進胞外ATP的水解生成腺苷，腺苷激活T細胞表達的A2受體抑制IL-2的產生，使活化的調節型T細胞以自體方式消除P2X7介導的功能和穩定性的抑制[25]。而胞外ATP與P2X7受體結合后可以抑制特異性轉錄因子Foxp3，抑制調節型T細胞的抑制潛能和穩定性，維持免疫耐受性[4]。胞外ATP上調參與免疫抑制和耐受的凝血酶敏感素-1和吲哚胺2，3-雙加氧酶的表達，凝血酶敏感素-1下調IL-12，抑制T細胞增殖，負調節獲得性免疫[20]。GTP和核苷濃度的改變也會抑制T細胞增殖[26]。

胞外ATP是NK細胞活性的調節劑，即可以抑制NK細胞的增殖和IFN-Y的分泌[24]。又可以阻斷趨化因子(C-X3-C基序)配體1(CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1)介導的NK細胞毒性和趨化性。胞外ATP與NK細胞表面的P2Y11受體相互作用增加趨化因子和對趨化因子(C-X-C基序)配體12[chemokine (C-X-C motif) ligand 12，CXCL12]的趨化性，同時抑制CX3CR1誘導的趨化性和NK細胞殺傷能力[25]。胞外UDP通過抑制IL-15激活雷帕霉素靶蛋白(m-TOR) 信號通路，影響Th1細胞分化，進而抑制 NK 細胞殺傷能力[16]。胞外ATP和相關的腺嘌呤核苷酸在降低NK細胞毒性中發揮作用。胞外ATP通過抑制NK細胞增殖，抑制NK細胞對K562靶細胞的細胞毒性。細胞外ATP還可以通過激活P2Y11受體調節NK細胞的細胞毒性[25]。

4 總結與展望

綜上所述，核苷酸不僅是核酸的基本單位，也在胞外空間調節細胞間信息交流。胞外核苷酸與P2受體結合，激活免疫細胞促進炎癥細胞的遷移、增殖、分化和釋放多種炎癥介質。炎癥條件下，細胞不僅應激或死亡后被動釋放核苷酸，也會通過非溶解機制主動釋放核苷酸。在免疫系統中胞外核苷酸是損傷相關模式分子，調節巨噬細胞、DCs、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞的功能。炎癥和免疫反應在多種人類疾病中起關鍵作用，而胞外核苷酸又可以調節炎癥和免疫應答。胞外核苷酸是治療多種疾病重要的藥理學靶標，同時P2受體靶向藥物也為治療炎癥疾病提供了潛在治療劑。對于胞外核苷酸調節免疫應答機制的深入研究具有深遠的生物學和藥理學意義。