痛瀉要方破壁飲片對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠腸推進及血管活性腸肽含量的影響*

胡 瑩，鄭依玲，梅全喜，彭偉文，宋 葉

（1.廣東省中山市中醫院，廣東 中山 528400；2.廣東省廣州市中西醫結合醫院，廣東 廣州 510800；3.廣東省深圳市寶安純中醫治療醫院，廣東 深圳 518101）

腸易激綜合征（IBS）為功能性腸道疾病[1]，臨床表 現為腹脹、腹瀉、腹痛及排便習慣改變等癥狀，臨床分型有便秘型（IBS-C）、腹瀉型（IBS-D）、混合型（IBS-M）及不定型（IBS-U），我國以 IBS-D發病率最高[2]。IBS-D的發病機制尚不明確，可能與腸動力異常、內臟敏感、腸道通透性增加及“腦腸軸”功能失調等因素相關[3]。現代療法常以脫敏、解痙為主，治療過程較長，需長期服藥，停藥后易復發，嚴重影響患者的生活質量。痛瀉要方出自《丹溪心法》[4]，由炒白術、炒白芍、炒陳皮和防風4味中藥組方，為治療脾虛泄瀉的傳統方劑，臨床常用于治療IBS-D，療效良好[5]。本研究中探討了痛瀉要方破壁飲片的藥效作用，為臨床應用破壁中藥飲片提供理論依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：MultisKan FC型酶標儀、洗板機（美國Thermo Scientific公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海橫平儀器儀表廠）；JY 92-IIN型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為65 W，頻率為20～25 kHz）；超微粉碎勻漿機（德國Fluko公司）；TD25-WS型48孔多管架自動平衡離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；TS-8型搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）；自動程控烘箱（杭州卓馳儀器有限公司）。

試藥：痛瀉要方破壁飲片（中山市中智藥業集團有限公司，批號為20160130）；匹維溴銨片（商品名得舒特，法國 Abbott Healthcare SAS公司，批號為642647）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號為78100150），RIPA裂解液（強）（批號為74k00153），均來源于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；Rat血管活性腸肽（VIP）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）KIT 96T試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號為05/2017）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批號為161115）。

動物：SPF級 SD大鼠 94 只，雄性，體質量（200±20）g，購于山東省醫學實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK（魯）20140007，飼養于廣東省中山市中醫院屏障級實驗室，實驗室動物使用許可證號為SYXK（粵）2015-0109。實驗室 12 h晝夜交替，室內恒溫（22±2）℃，相對濕度40% ～70%，統一適應性喂養1周。

1.2 方法

藥液制備：稱取適量痛瀉要方破壁飲片，用90℃水充分溶解，混勻，配制成痛瀉要方破壁飲片低、中、高劑量溶液，濃度分別為 1.015g/kg（臨床 1/4 量）、2.030 g/kg（臨床 1/2 量）、4.060 g/kg（臨床 1 倍量），放涼，置 4 ℃冰箱保存，待用。取匹維溴銨片碾碎，用蒸餾水溶解，配制成質量濃度為0.018 g/kg的陽性對照藥液，置4℃冰箱保存，待用。

IBS-D動物模型建立：采用改良慢性束縛刺激法[6]建立IBS-D動物模型。隨機挑選8只SD大鼠作為正常組，其余大鼠全部參與造模。造模大鼠每日于固定時間捆綁束縛3 h，再隨機選擇另一種復合刺激方式補充刺激。復合刺激方式包括晝夜顛倒12 h/12 h，禁食24 h，強迫游泳 30 min，禁飲 24 h，懸尾 1 h，孤養 12 h，飲糖水24 h。每種方法隨機重復2～3次，大鼠連續刺激造模21 d，造模期間觀察大鼠的體質量、行為活動、飲食飲水等變化。

動物分組及給藥：將造模大鼠隨機分為6組，分別為模型組，匹維溴銨組，痛瀉要方破壁飲片低、中、高劑量組。各組大鼠于造模后第7天開始灌胃給藥，連續21 d，每天1次，正常組及模型組灌胃等體積蒸餾水。

樣本采集：試驗結束前1 d，所有動物均禁食不禁飲18 h，并于末次灌胃給藥后將大鼠置代謝籠內1 h收集糞便，腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉大鼠，待翻正反射消失后迅速打開腹腔采集腹主動脈血；同時取出大鼠遠端結腸組織并分為2段，分別置液氮及4%多聚甲醛中儲存；最后打開大鼠頭骨，取出大腦組織，將其分為2份，分別置液氮及4%多聚甲醛儲存。將液氮中的結腸組織、腦組織標本隨后移入-80℃冰箱中保存。

1.3 觀察指標

體質量：造模期間注意觀察動物的狀態、毛色及飲食飲水狀態，并記錄試驗期間大鼠第 1，7，14，21，28天體質量變化情況。

排便情況：觀察大鼠第 1，7，14，21，28 天的排便情況，于代謝籠中收集大便，按照Bristol評分系統[7]評估，并記錄大鼠排便粒數。詳見表1。

表1 Bristol大便分級評分標準Tab.1 Bristol classification and scoring criteria

小腸推進率：大鼠末次灌胃給藥后1 h，每只大鼠灌胃自制營養糊（活性炭與奶粉比例為1∶5，m/m）2 mL，待腸蠕動30 min后將大鼠依據灌胃營養糊先后順序處死，取出小腸，用直尺測量小腸全長及營養糊推進長度，并計算小腸推進率，小腸推進率（%）=（推進長度/小腸全長）×100%。

血清、結腸及腦組織中VIP含量（ELISA法）：血漿于4℃條件下靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒步驟測定血清中VIP含量。將結腸組織從-80℃冰箱中取出，室溫解凍，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗凈，濾紙吸干多余液體，用眼科剪剪碎，并加入裂解液，用超聲波細胞粉碎機粉碎10 s，再用手持式超微粉碎勻漿儀進一步粉碎（以上步驟均在冰浴條件下完成），勻漿液于12 000 r/min離心20 min，取勻漿上清液進行蛋白定量，并按ELISA試劑盒步驟測定VIP含量。將腦組織從-80℃冰箱中取出，于室溫解凍，取出腦組織，勻漿制作及測定步驟與結腸組織相同。

結腸、大腦組織形態學：將取出的大鼠結腸組織及腦組織放入10%多聚甲醛中固定，常規脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，于光學顯微鏡下觀察。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 體質量變化

與正常組比較，模型組大鼠造模后體質量下降明顯，第 7天體質量最低（P ＜0.05），第 14，21，28 天體質量緩慢回升，但仍處于較低水平（P＜0.05）。與模型組比較，第7天，各給藥組大鼠體質量均上升，差異無統計學意義（P＞0.05）；第21，28天，各給藥組大鼠體質量回升明顯（P＜0.05），破壁飲片高劑量組效果較好，結果與匹維溴銨組最接近。詳見表2。

2.2 排便情況

與正常組比較，模型組大鼠糞便Bristol評分顯著升高（P＜0.05），造模后大鼠大便性狀改變明顯，形狀不規則多呈糊狀，或排稀便、水便。與模型組比較，造模第7天各給藥組大鼠Bristol評分差異無統計學意義（P＞0.05）；造模第14，21，28天各給藥組大鼠隨著給藥時間的延長，大便性狀逐漸改善，糞便Bristol評分逐漸回落，各給藥組評分第28天最低（P＜0.05）。詳見表3。

與正常組比較，模型組大鼠排便數量于造模后第7天急劇升高（P ＜0.05），第 14，21，28天均維持在較高數量（P＜0.05）。與模型組比較，破壁飲片各劑量組大鼠造模第7天排便數量均大幅度增加，差異無統計學意義（P＞0.05）；隨著給藥時間的延長，各給藥組第14，21，28天排便粒數逐漸減少（P＜0.05），第28天各組大鼠排便數量最少，其中破壁飲片高劑量組效果與匹維溴銨組接近，呈濃度依賴性。詳見表4。

表2 各組大鼠體質量比較（±s，g，n=8）Tab.2 Comparison of body mass of rats in each group（±s，g，n=8）

表2 各組大鼠體質量比較（±s，g，n=8）Tab.2 Comparison of body mass of rats in each group（±s，g，n=8）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與正常組比較，#P＜0.05。下表同。Note：Compared with those in the model group，*P ＜ 0.05；compared with those in the normal group，#P ＜ 0.05；as well as the following tables.

組別正常組模型組匹維溴銨組破壁飲片 低劑量組中劑量組高劑量組劑量（g/kg）0.018 1.015 2.03 4.06第1天236.00±2.83 237.60±3.66 240.73±4.76 237.78±3.88 233.69±5.21 233.33±3.30第7天239.25±5.34*216.40±2.55#219.09±6.20 217.80±3.79 218.22±5.89 216.73±4.90第14天252.13±4.61 220.40±8.50#235.82±4.94*227.30±7.32 223.89±5.46 230.00±4.56*第21天261.88±3.13 225.00±3.89#245.27±5.18*238.20±7.69*236.33±5.15*242.73±4.98*第28天277.13±3.27 227.80±3.94#250.55±5.16*243.10±4.51*241.22±4.66*248.36±3.98*

表3 各組大鼠糞便Bristol評分比較（±s，分，n=8）Tab.3 Comparison of Bristol scores in feces of rats in each group（±s，point，n=8）

表3 各組大鼠糞便Bristol評分比較（±s，分，n=8）Tab.3 Comparison of Bristol scores in feces of rats in each group（±s，point，n=8）

組別正常組模型組匹維溴銨組破壁飲片 低劑量組中劑量組高劑量組劑量（g/kg）0.018 1.015 2.03 4.06第1天3.33±0.50 3.30±0.48 3.50±0.52 3.40±0.52 3.45±0.52 3.42±0.52第7天3.33±0.50 5.00±0.67#4.67±0.78 4.90±0.88 5.18±0.75 4.92±0.79第14天3.33±0.50 6.10±0.74#4.75±0.75*5.50±0.53 5.27±0.47*5.00±0.60*第21天3.33±0.50*6.50±0.53#4.67±0.65*5.30±0.48*5.18±0.40*4.92±0.51*第28天3.33±0.50*6.70±0.48#4.42±0.67*4.90±0.74*4.82±0.60*4.67±0.65*

表4 各組大鼠排便粒數比較（±s，粒，n=8）Tab.4 Comparison of fecal pellets of rats in each group（±s，pellet，n=8）

表4 各組大鼠排便粒數比較（±s，粒，n=8）Tab.4 Comparison of fecal pellets of rats in each group（±s，pellet，n=8）

組別正常組模型組匹維溴銨組破壁飲片 低劑量組中劑量組高劑量組劑量（g/kg）0.018 1.015 2.03 4.06第1天9.88±2.36 9.10±2.02 8.42±2.02 8.50±2.17 8.55±1.97 9.67±2.39第7天9.50±1.85*33.30±3.34#31.67±2.77 34.30±2.50 33.36±2.29 32.25±2.22第14天9.50±1.60*38.90±1.91#26.83±2.21*30.20±2.78*30.64±1.80*29.92±3.18*第21天9.25±1.67*41.70±2.31#23.92±2.35*27.10±3.48*25.36±3.35*26.58±3.11*第28天9.38±1.60*41.60±3.20#18.92±2.54*24.00±2.26*22.73±1.68*21.17±2.72*

2.3 小腸推進率

與正常組比較，模型組大鼠小腸推進長度明顯延長，小腸推進率大幅度提高（P＜0.05）。與模型組比較，破壁飲片各劑量組大鼠小腸推進長度縮短，小腸推進率下降（P ＜0.05）。詳見表 5。

表5 各組大鼠小腸推進率比較（±s，n=8）Tab.5 Comparison of small intestinal propulsion rate in each group（±s，n=8）

表5 各組大鼠小腸推進率比較（±s，n=8）Tab.5 Comparison of small intestinal propulsion rate in each group（±s，n=8）

組別正常組模型組匹維溴銨組破壁飲片 低劑量組中劑量組高劑量組劑量（g/kg）0.018 1.015 2.03 4.06小腸長度（cm）105.88±6.58 103.75±4.65 106.50±5.21 103.38±5.73 102.88±4.85 102.50±5.01推進長度（cm）57.13±5.17*82.38±3.54#61.63±6.97*77.13±4.16 75.13±6.38 69.00±6.00*小腸推進率（%）53.96±3.71*79.43±2.17#57.75±4.46*74.75±4.96 73.05±5.53*67.28±4.27*

2.4 血清、結腸及腦組織中VIP含量

與正常組比較，模型組大鼠血清、結腸及下丘腦VIP含量顯著下降（P＜0.05）。與模型組比較，破壁飲片各劑量組大鼠血清、結腸及下丘腦中VIP含量顯著上升（P ＜0.05）。詳見表 6。

表6 各組大鼠血清、結腸及下丘腦VIP水平比較（±s，pg/mL，n=8）Tab.6 Comparison of VIP level in serum，colon and hypothalamus of rats（±s，pg/mL，n=8）

表6 各組大鼠血清、結腸及下丘腦VIP水平比較（±s，pg/mL，n=8）Tab.6 Comparison of VIP level in serum，colon and hypothalamus of rats（±s，pg/mL，n=8）

組別 劑量（g/kg）VIP正常組模型組匹維溴銨組破壁飲片 低劑量組中劑量組高劑量組0.018 1.015 2.03 4.06血清153.79±40.26*84.59±10.16#143.75±17.09*103.44±16.49 144.96±18.08*143.94±20.61*結腸241.40±21.81*118.13±24.07#220.21±23.18*151.06±30.63 177.62±23.24*208.29±17.41*腦組織248.57±18.67*139.32±13.34#221.38±9.35*135.41±12.07 181.22±14.57*207.81±15.35*

2.5 結腸、大腦組織形態學

結腸病理切片結果：正常組大鼠腸黏膜上皮細胞排列規則整齊，上皮細胞未見壞死脫落，黏膜層未見炎性細胞浸潤，固有層腺體未見萎縮減少，黏膜下層血管未見充血水腫，肌層未見萎縮溶解性改變。與正常組比較，模型組大鼠腸黏膜層上皮細胞有壞死脫落，黏膜結構輕微破壞，固有層中可見少量炎性細胞浸潤，腺體未見明顯萎縮，黏膜下層和肌層未見明顯病理改變。與模型組比較，破壁飲片低、中、高劑量組大鼠的腸黏膜上皮細胞排列規則整齊，未見壞死脫落細胞及明顯炎性細胞浸潤，固有層中腺體未見萎縮及減少，黏膜下層及肌層未見明顯病理改變；匹維溴銨組除腸黏膜可見個別上皮細胞壞死脫落，其余均未見明顯病理改變。詳見圖1。

大腦病理切片結果：正常組大鼠海馬細胞排列密集，中樞神經纖維未見扭曲及萎縮性改變。與正常組比較，模型組大鼠海馬顆粒層神經元細胞核發生明顯固縮，神經纖維變得短粗、扭曲。與模型組比較，破壁飲片低、中劑量組大鼠腦海馬神經元細胞發生固縮，細胞層數減少、稀疏，神經纖維短粗、扭曲，稀疏變淡；而破壁飲片高劑量組大鼠海馬顆粒層神經元細胞排列緊密，未見神經元細胞核發生固縮，神經纖維排列密集未見扭曲、萎縮等改變。詳見圖2。

3 討論

IBS是一種反復發作、腸道功能紊亂的慢性疾病[1]，病程綿延反復，嚴重影響患者的生活質量。IBS-D屬中醫“泄瀉”范疇。中醫認為，人體內肝主疏泄，善調氣機，喜條達而惡抑郁；脾主受納，善運化水谷精微，如肝氣郁結而犯脾土，肝脾失調，則影響脾運化水谷，脾運失常導致消化不良，易出現腹脹、腹瀉、腹痛及情志失調、焦慮等癥狀，與IBS-D病機相似。痛瀉要方出自朱丹溪的《丹溪心法》[4]，乃治療肝郁脾虛痛瀉之良方，現代臨床常用于治療IBS-D[8]。

本研究結果顯示，與模型組比較，痛瀉要方破壁飲片各劑量組可有效控制IBS-D大鼠體質量下降，通過減少大便次數及稀便情況緩解腹瀉癥狀，還可減慢腸蠕動，降低腸道推進率，同時刺激IBS-D大鼠腸道分泌VIP，抑制腸道運動過速。表明痛瀉要方破壁飲片對IBS-D有較好療效，其中破壁飲片高劑量組效果最好，優于破壁飲片低、中劑量組。

A.正常組 B.模型組 C.匹維溴銨組 D.破壁飲片低劑量組 E.破壁飲片中劑量組 F.破壁飲片高劑量組圖1 各組大鼠結腸組織病理切片（HE，×10）A.Normal group B.Model group C.Pinaverium bromide group D.Low-dose ultrafine granular powder group E.Medium-dose ultrafine granular powder group F.High-dose ultrafine granular powder groupFig.1 Pathological sections of colonic tissues of rats in each group（HE staining，×10）

A.正常組 B.模型組 C.匹維溴銨組 D.破壁飲片低劑量組 E.破壁飲片中劑量組 F.破壁飲片高劑量組圖2 各組大鼠腦組織病理切片（HE，×10）A.Normal group B.Model group C.Pinaverium bromide group D.Low-dose ultrafine granular powder group E.Medium-dose ultrafine granular powder group F.High-dose ultrafine granular powder groupFig.2 Pathological sections of brain tissues of rats in each group（HE staining，×10）

VIP是一種抑制性胃腸道調節激素[9]，具有舒張血管及松弛平滑肌的作用，可直接抑制胃腸道平滑肌的收縮，同時還可通過促進一氧化氮（NO）與環磷酸腺苷（cAMP）合成，再次抑制胃腸平滑肌的運動，減慢胃腸道蠕動，降低胃排空及腸推進速度，提示大鼠腸道VIP分泌異常可能與IBS-D發病密切相關[10-11]。痛瀉要方破壁飲片可有效促進IBS-D大鼠腸道分泌VIP，達到止瀉作用，故推測有效調節大鼠腸道VIP分泌可能是痛瀉要方破壁飲片治療IBS-D的作用機制之一。

研究表明，中藥飲片經破壁技術處理后并不會破壞有效成分[12]。且前期研究發現，痛瀉要方中藥飲片與破壁飲片有效成分及含量一致[13-14]，說明破壁飲片可發揮與傳統中藥飲片相同的藥效作用，同時具有給藥劑量準確、獨立包裝、攜帶方便的優勢，不需要煎煮，熱水沖服即可，對于不方便煎煮中藥或是不接受服用大劑量湯劑的患者更有優勢。建議臨床可將破壁飲片作為傳統中藥飲片的補充品種，為進一步應用中醫藥服務廣大患者帶來便利。