固相萃取-超高效液相色譜法同時測定舒肝和胃丸中5種成分含量*

梁冬牛，陳 峰，鄭 磊△

（1.山東省立第三醫院，山東 濟南 250031；2.華潤山東醫藥有限公司，山東 濟南 250031）

舒肝和胃丸由佛手、白芍、陳皮、醋香附、木香等13味中藥組方，舒肝解郁、和胃止痛[1]1603，用于治療肝胃不和、兩脅脹滿、胃脘疼痛、食欲不振、呃逆嘔吐、大便失調[2]。方中，佛手疏肝理氣、和胃止痛[1]178，陳皮理氣健脾、燥濕化痰[1]191，白芍養血調經、柔肝止痛、平抑肝陽[1]105。其質量標準收載于2015年版《中國藥典（一部）》，以芍藥苷含量作為質量控制指標。單一成分的含量作為該藥的質量控制指標，不能有效控制組方中其他組分的質量水平，更不能有效控制產品質量[3-5]。單婷婷等[6]的研究僅對舒肝和胃丸中的揮發性成分進行控制，缺少對多種組分的綜合評價。與傳統高效液相色譜（HPLC）法相比，超高效液相色譜（UPLC）技術具有分析速度快、靈敏度高、節約流動相等優點[7-9]，尤其是用于分析多組分樣品時可顯著提高分析效率。該制劑中，佛手為君藥，白芍和陳皮為臣藥。本研究中以白芍、陳皮和佛手中的主要成分芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷、歐前胡素和佛手柑內酯為研究對象，建立測定其含量的固相萃取-超高效液相色譜（SPE-UPLC）法，以綜合評價產品質量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1290型超高效液相色譜儀[配有二極管陣列（DAD）檢測器、自動進樣器、柱溫箱，BOND ELUT型固相萃取（SPE）柱（500 mg ∶3 mL），均購自美國 Agilent公司）]；XP205型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為十萬分之一）；KQ-600DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為600 W，頻率為40 kHz）；Milli-Q advantage A10型超純水機（美國密理博公司）；HSE-24B型固相萃取裝置（天津市恒奧科技公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號為110736-201943，含量為95.1%），橙皮苷對照品（批號為110721-201818，含量為96.2%），柚皮苷對照品（批號為110722-201815，含量為 91.7%），歐前胡素對照品（批號為 110826-201918，含量為99.0%），佛手柑內酯對照品（批號為520036-201401，含量為99.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；舒肝和胃丸（大蜜丸，北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，規格為每丸6 g，批號分別為19013386，18011800，18011801，200202，200401）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；磷酸（優級純，中國醫藥集團有限公司）；超純水（實驗室自制）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 SB-C18柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流速：0.5 mL/min；檢測波長：230 nm（芍藥苷），283 nm（橙皮苷、柚皮苷），248 nm（歐前胡素、佛手柑內酯）；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；流動相：甲醇（A）-0.1% 磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時 10%A～40%A，10～15 min時 40%A～45%A，15～20 min時45%A ～100%A）。

2.2 溶液制備

供試品溶液：取樣品適量，研碎，取2.0 g，精密稱定，用定量濾紙包好，置索氏提取器中，加甲醇100mL，采用索氏提取法提取1 h，蒸干提取液，殘渣加甲醇1 mL溶解，加入預先活化的SPE柱，加水3 mL通過SPE柱，棄水，再用70%甲醇10 mL洗脫，收集洗脫液，置50 mL容量瓶中，并用甲醇定容，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

對照品溶液：取芍藥苷對照品22.92 mg，橙皮苷對照品26.26 mg，柚皮苷對照品10.46 mg，歐前胡素對照品35.28 mg，佛手柑內酯對照品47.45 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，作為對照品貯備溶液；分別精密量取各對照品貯備溶液1 mL，置同一100mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：按2015年版《中國藥典（一部）》方法，取方中除白芍、陳皮、佛手的10味中藥飲片，按樣品制備方法制備不含白芍、陳皮、佛手的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別取2.2項下3種溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。結果各成分色譜峰峰形對稱，且與相鄰色譜峰分離度良好，陰性對照無干擾。采用UPLC儀自帶的DAD檢測器光譜學純度檢測功能，分別檢測5種成分色譜峰的光譜學純度，結果均在儀器給出的閾值范圍內，表明5種待測成分色譜峰均為單一的色譜峰，無色譜峰重疊干擾。

線性關系考察：取對照品貯備溶液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，分別置100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得各對照品標準系列溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，以各對照品溶液的質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積積分值（Y）為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。結果見表1。

精密度試驗：精密量取同一對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，連續測定6次。結果見表1，表明儀器精密度良好。

1.芍藥苷 2.橙皮苷 3.柚皮苷 4.歐前胡素 5.佛手柑內酯A.對照品溶液 B.陰性對照品溶液 C.供試品溶液圖1 超高效液相色譜圖1.paeoniflorin 2.hesperidin 3.naringin 4.imperatorin 5.bergaptenA.Reference solution B.Negative reference solution C.Test solutionFig.1 UPLC chromatograms

表1 線性關系、精密度、穩定性及重復性試驗結果Tab.1 Results of linear relationship，precision，stability and repeatability tests of five components

穩定性試驗：取樣品（批號為19013386）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于 0，4，8，12，24 h 時進樣，記錄各成分色譜峰峰面積。結果見表1，表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為19013386）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，共6份，分別進樣測定，記錄各成分色譜峰峰面積，并計算含量。結果見表1，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為19013386）1.0 g，共 6份，精密稱定，置索氏提取器中，分別精密加入對照品貯備溶液0.25 mL，依法制備供試品溶液，進樣測定，計算5種待測成分的回收率。結果見表2。

耐用性試驗：取2.2項下供試品溶液，分別考察不同型號高效液相色譜儀（Agilent 1290型和LC20A型）、色譜柱[Poroshell120SB-C18柱（100mm×4.6mm，2.7μm）和 Accucore C18柱（100 mm ×4.6 mm，2.6 μm）]、柱溫（30 ℃，40 ℃和室溫）和流速（0.45，0.50，0.55 mL/min）對檢測結果的影響。結果在上述范圍內改變色譜條件，各色譜峰分離度均良好，表明方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

取樣品適量，依法制備供試品溶液，分別進樣測定2次，計算各成分含量。結果見表3。

3 討論

3.1 色譜條件選擇

UHPLC技術具有靈敏度高、分離度好、分析周期短的優點，更適合于檢測中藥中多種成分。Poroshell 120 SB-C18柱為表面多孔型顆粒填料，即核-殼型填料，具有極窄的粒徑分布和擴散路徑，可減小渦流擴散，縮短傳質路徑和減弱傳質阻力，柱效較高[10]，故色譜柱選用Poroshell 120 SB-C18柱。舒肝和胃丸中5種成分具有不同的紫外吸收特征，王楨旭[4]報道的芍藥苷為230 nm，楊冰[11]報道的柚皮苷和橙皮苷為283 nm，彭春梅等[12]報道的歐前胡素為248 nm，王向鋒等[13]報道的佛手柑內酯為248 nm。本研究中采用DAD檢測器，掃描5種成分的紫外吸收曲線，發現5種成分分別于230，283，248 nm波長處具有較強紫外吸收，這與文獻報道一致，故分別選用 230 nm（芍藥苷）、283 nm（橙皮苷、柚皮苷）、248 nm（歐前胡素、佛手柑內酯）作為檢測波長。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests（n=6）

3.2 提取方式選擇

分別考察了索氏提取法、超聲波提取法和加熱回流提取法的提取效果。采用超聲波提取法時，需使用甲醇150 mL，分3次提取，然后合并提取液，提取過程較復雜；采用加熱回流提取法時，提取過程與索氏提取法相似，但提取回收率僅為90%，略低于索氏提取法，推測原因可能是采用加熱回流提取法時，并不能將樣品中的待測成分完全轉移到提取液中；索氏提取法采用少量的提取溶劑即可將待測成分全部轉移到提取溶劑中，提取效率較高[14]，故采用索氏提取法提取樣品。舒肝和胃丸由13味中藥組方，所含成分復雜，尤其是水溶性糖類成分對分離效果影響很大，且會嚴重損耗色譜柱的使用壽命，為了減少其他成分對待測成分的干擾，故采用SPE柱富集與靜態吸附待測成分，然后用強極性溶劑解析，盡可能除去其他成分的干擾。分別考察了以50%，70%，90%甲醇作為洗脫液時的洗脫效果，結果采用10mL 70%甲醇可將待測成分完全洗脫，且干擾雜質較少，故選用10 mL 70%甲醇為洗脫液。

表3 樣品含量測定結果（mg/g，n=2）Tab.3 Results of content determination（mg/g，n=2）

3.3 方法評價

舒肝和胃丸為2015年版《中國藥典（一部）》中收載的中成藥制劑，臨床用量較大，但藥典和已發表的文獻均采用單一成分含量作為其質量控制指標，未綜合評價組方中的多種組分，存在較嚴重的缺陷。本研究中以白芍、陳皮和佛手為研究對象，采用UPLC方法測定5種成分的含量，可有效控制該制劑的質量，方法重復性好，結果準確，可為舒肝和胃丸的質量控制提供理論依據。