蛋白質-蛋白質相互作用的實驗檢測方法

孔文娜 周 宓 林海霞 王任小

(1.上海大學理學院, 上海 200444;2.中國科學院上海有機化學研究所生命有機化學國家重點實驗室, 上海 200032)

蛋白質是生命體的重要組成部分, 是生命活動的主要承擔者和執行者.人類基因組由20 000～30 000 個可編碼超過50 萬種不同蛋白質的基因組成[1].隨著人類基因組計劃的完成,旨在研究全基因組水平上所有蛋白質的表達、結構以及功能[2]的蛋白質組學已然成為后基因時代的研究熱點.據估計, 超過80%的蛋白質并不是孤立存在, 而是與其他蛋白質通過相互作用形成穩定或瞬時的復合物結構[3].蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interactions,PPIs)是分子生物學中最重要的現象之一, 幾乎在所有的生命過程如細胞通訊、代謝、轉運、信號轉導、免疫應答和基因轉錄中, 都起著核心作用.通過研究蛋白質-蛋白質相互作用, 可以探究蛋白質在生命過程中的作用以及發揮功能的機制, 更好地理解生命過程.因此, 對蛋白質-蛋白質相互作用的研究, 已成為生命科學研究的熱點之一[4].

蛋白質-蛋白質相互作用是生物分子網絡中的基本組成元件, 但是異常的蛋白質-蛋白質相互作用很有可能會導致腫瘤的發生和發展.因此, 蛋白質-蛋白質相互作用的位點也成為新興的一類藥物靶點, 例如G 蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)、核激素受體、離子通道和酶等[5].癌癥、心血管疾病、免疫系統疾病等均有以靶向蛋白質-蛋白質相互作用的研究, 如細胞色素c-細胞色素c 氧化酶[6]、PD-1-PD-L1[7]、APE1-Ref-1[8]、MDM2—p53[9]等.因此, 研究PPIs 為開發治療疾病的新藥提供了更多機會[10].

隨著蛋白質組學的飛速發展, 用于表征蛋白質-蛋白質相互作用的方法相繼提出。比較傳統的技術方法有熒光偏振、核磁共振、酵母雙雜交和免疫共沉淀等.近年來新發展的方法包括生物膜干涉技術、微量熱泳動(microscale thermophoresis, MST)技術、AlphaScreen 和蛋白質片段互補分析技術等.表1 中總結了9 種基于生物物理和生物化學原理, 并被廣泛用于表征蛋白質-蛋白質相互作用的常用實驗技術以及近年來發展的新檢測方法.

表1 蛋白質相互作用方法的比較分析Table 1 Comparisons of methods for protein-protein interaction

1 基于生物物理原理的檢測方法

1.1 表面等離子共振

表面等離子共振(surface plasmon resonance, SPR)是一種基于物質間相互作用所導致芯片表面質量變化而產生的一種光學現象。目前, SPR 生物傳感器已經廣泛用于研究生物分子間的相互作用, 可以對蛋白質-蛋白質相互作用進行實時、無標記檢測.SPR 的原理(見圖1(a))是先將一種蛋白質分子通過共價結合或親和捕獲的方式固定在生物芯片表面, 再將待測分析物注入并流經芯片表面, 蛋白質分子間的結合會引起芯片表面質量增加, 從而導致表面折射率按同比例增強, 蛋白分子間反應的變化即被觀察到, 這種變化用反應單位(reaction unit,RU)來衡量.傳感器表面與待研究蛋白質之間的界面是傳感器系統的重要組成部分, 一般購買商業芯片, 其中包括通過氨基偶聯的CM5 芯片、用于固定His 標簽蛋白的NTA 芯片和用于固定生物素化蛋白的SA 芯片.

圖1 表征PPIs 的生物物理方法示意圖Fig.1 Schematic diagrams of biophysics methods used to represent PPIs

與熒光或酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)相比, SPR 技術具有很多優點: ①測量基于折射率的變化, 分析物不需要任何標記, 可直接檢測; ②測量可以實時進行, 研究人員能及時獲得動力學數據和熱力學數據; ③作為一種多功能技術, 能夠檢測各種分子量的蛋白質.基于以上特點, SPR 已成為研究生物分子間相互作用的有力工具[11].以MDM2-p53 的相互作用為例, Wu等[12]采用雙通道SPR 傳感器測定在肉瘤組織提取的游離態和與p53 結合的MDM2 的水平, 為了獲得更高的靈敏度和特異性, 使用MDM2 特異單克隆抗體(2A10)識別游離態和與p53 結合的MDM2, 發現由肉瘤組織提取的游離態和總MDM2(游離和結合形式組合)蛋白質的濃度比正常組織提取的高, 并且與p53 結合的MDM2蛋白質僅占總MDM2 濃度的一小部分.但是, SPR 技術的缺點是難以區分實驗過程中的非特異性吸附, 對實驗結果造成影響.

傳統的SPR 技術限于低通量研究, 因為標準SPR 生物傳感器僅在單個傳感器芯片上包含3～4 個流動池.如今隨著技術的革新, 表面等離子共振成像(surface plasmon resonance imaging, SPRI) 正在向高通量篩選(high-throughput screening, HTS)發展.結合蛋白質陣列技術和電荷耦合器件(charge-coupled device, CCD)相機, 并根據反射光的強度制作圖像,SPRI 已經發展到能同時處理成千上萬個樣本[10,13].

1.2 生物膜干涉

生物膜干涉(biolayer interferometry, BLI)是近年來新發展起來的一種基于光干涉量度法的檢測技術, 可用于實時、快速、以非標記方式分析生物分子之間的相互作用.BLI 技術(見圖1(b))將相互作用的生物分子之一通過氨基偶聯、生物素/鏈霉親和素、組氨酸標簽/鎳離子螯合劑等方式固定于光纖制成的生物傳感器末端, 形成生物膜層.當一束可見光垂直入射生物膜層時, 光在生物膜層的兩個界面反射后形成一束能被光譜儀檢測到的干涉光譜.當固定分子與溶液中的分析物發生相互作用時, 生物膜層厚度發生變化, 通過檢測干涉現象的相位移動,從而能夠分析結合到傳感器上的分子數量的變化[14-15].

BLI 技術的應用十分廣泛, 可以檢測生物分子之間是否存在特異性結合.研究人員已將BLI 技術廣泛用于蛋白質-蛋白質相互作用的研究, 如Pogoutse等[16]利用BLI 技術測定兩組蛋白質相互作用對Mms2/Ubc13、鐵轉蛋白/TbpB 間的結合常數.該工作采用了鏈霉親和素固定的方式, 目標蛋白在體內實現生物素酰化過程, 隨后以細胞裂解液取代純化的蛋白, 通過BLI 測得結合常數, 既經濟又省時.

BLI 技術具備實時監測、非標記、高通量、快速檢測等優點, 可檢測親和力為10?10～10?4mol/L 的相互作用, 并且可提供結合的親和力KD值及動力學信息.相比表面等離子共振的微流控系統, BLI 技術侵入即讀的檢測手法更為簡便, 且實驗結果不受樣品折射率影響,但是實驗過程中需要注意分析物是否與生物膜層存在非特異結合.另外, 樣品緩沖液中所包含的部分去垢劑可能形成非均勻膠束, 從而引起生物膜層非均勻性厚度變化, 對檢測結果產生影響[15].

1.3 微量熱泳動

MST 技術可以檢測分子在微觀溫度梯度場中的定向運動, 因此也被稱之為熱泳動.定向運動現象對由結合引起的分子大小、電荷、構象或水化層的細微變化十分敏感, 因而可以用來研究蛋白質-蛋白質之間的相互作用[17].MST 技術示意圖見圖1(c).實驗過程中, 對相互作用的蛋白質分子其中之一進行熒光標記, 以溶液形式均勻分布于毛細管中.隨后, 毛細管在紅外激光照射下形成局部溫度梯度, 標記分子因熱泳動作用力而遠離加熱區域, 經歷溫度躍遷(T-jump)后達到穩定態.在關閉激光后, 標記分子經歷逆向溫度躍遷和反向擴散后, 恢復到均勻分布的狀態[18-20].上述這一過程會受到由結合引起的分子大小、電荷或水化層變化的影響,因而通過逐步滴定與標記分子相互作用的蛋白質, MST 技術可用來測定蛋白質-蛋白質相互作用的解離常數[21-22].

MST 技術可以很容易地測量蛋白質結合的過程, 目前越來越多地應用于與疾病相關的蛋白質相互作用的研究中, 從而揭示疾病發生的分子機制.例如, 纖毛結構或者長度的失調會引發疾病.纖毛的前體微管蛋白(tubulin)在纖毛內運輸與兩個關鍵蛋白質IFT74 和IFT81有關.Bhogaraju等[23]利用MST 技術研究人類重組IFT81、IFT74 與牛的αβ-tubulin 之間的偶聯特征, 實驗發現IFT74/81 復合物比單獨IFT81 與tubulin 的結合力大大增強, 證明了與tubulin 相偶聯的模塊是由IFT74/81 復合物組成, 而不是單獨的IFT81.

MST 技術相比與其他體外結合實驗的優勢在于: ①樣品無需固定處理; ②樣品用量少,可對μL 級的溶液進行檢測; ③對相對分子質量沒有限制; ④可以進行快速檢測, 結合活性實驗可在10 min 內完成測定; ⑤可以測定pmol/L 級的親和活性.此外, MST 技術可以對復雜的生物體系如細胞裂解液、血漿等進行測定[24].通常, MST 技術需要熒光團標記蛋白質分子.

2 基于生物化學原理的檢測方法

2.1 熒光共振能量轉移

熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 是指熒光供體在受到激發光激發后不發射出光子而將激發的能量轉移到熒光受體上的現象(見圖2(a))[25].在對蛋白質-蛋白質相互作用的研究中, 分子間FRET 僅在熒光供體和受體相距非常近即形成復合物時發生.因此, 要產生FRET 現象需要滿足3 個條件: ①供體發射光譜與受體激發光譜有重疊; ②熒光供體和受體之間的距離在10 nmol/L 范圍內; ③供體與受體之間遷移偶極子的方向平行.目前, 廣泛用于供體與受體標記的熒光染料來自于綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的變異體, 包括青色熒光蛋白-黃色熒光蛋白(cyan fluorescent protein-yellow fluorescent protein, CFP-YFP)[26]、藍色熒光蛋白-GFP(blue fluorescent protein-GFP, BFP-GFP)[27]、CyPet-Ypet[28]、MiCy-mKO[29]、CrFP-YFP[30]等.隨著對FRET 方法的優化, 該技術已被廣泛應用于體外測定結合活性并篩選蛋白質-蛋白質相互作用抑制劑[10,31].蛋白被小型泛素樣修飾物(small ubiquitin-like modifier, SUMO)修飾是真核生物界的重要修飾途徑.SUMO可以組裝成聚合鏈, 與包含兩個SUMO 相互作用基序(SUMO-interaction motif, SIM)的受體蛋白質相結合, 從而對受體蛋白質進行修飾.Kost等[32]設計了一種FRET 傳感器, 用于測定SUMO 線型二聚體與包含SIM 蛋白質的結合,利用馬來酰亞胺和銅催化的點擊化學反應將合成受體和供體的染料偶聯到SUMO 亞基上, 在多個SIM 配體存在的情況下監測FRET 變化.因此,開發FRET 傳感器對于研究SUMO-SIM的相互作用具有非常重要的價值.

圖2 表征PPIs 的生物化學方法示意圖Fig.2 Schematic diagram of biochemical methods used to represent PPIs

結合顯微成像技術的FRET 可對活細胞內兩個蛋白質分子間相互作用進行實時觀察和定量測定, 具有非常高的時空分辨率.然而, 由于FRET 顯微鏡依賴于從蛋白質-蛋白質相互作用中收集熒光信號, 因此它具有一些缺點, 包括自發熒光、檢測器噪聲、光學噪聲干擾等.FRET技術也可與流式細胞儀聯用.Mahajan等[33]利用FRET 與流式細胞儀相結合, 研究酵母細胞中蛋白質-蛋白質相互作用, 在短時間內分析大量細胞, 在統計學上產生比顯微鏡技術更強大的結果.

2.2 AlphaScreen 技術

AlphaScreen 技術及AlphaLISA 技術都是利用作為供體和受體的微珠來檢測生物分子間的相互作用.這一方法(見圖2(b))的關鍵組分為直徑為250～350 nm, 并分別被不同官能團包裹的供體微珠和受體微珠, 它們分別作為光敏劑和化學發光單元.在PPIs 的研究中, 在波長為680 nm 的激光照射下, 兩個目標蛋白質的相互作用會將供體微珠和受體微珠拉近, 其中供體微珠上的光敏劑將周圍環境中的氧氣激發為活潑的單線態氧, 單線態氧擴散至受體微珠, 并與受體微珠上的化學發光劑反應, 進一步激活了受體微珠上的熒光基團, 使之發出520～620 nm 的熒光, 從而被檢測[34-35].

AlphaScreen 技術可應用于復雜的蛋白質之間的相互作用, 包括配體與GPCR 結合[36]、激酶與底物結合[37]、生長因子與受體的結合[38]以及轉錄因子同激活子或抑制子[39]之間的相互作用等.分選蛋白(sorting nexin, SNX) 在真核生物膜轉運功能調節上具有重要的作用,Sierecki等[40]利用AlphaScreen 方法研究了含有BAR 結構域的分選蛋白(SNX-BAR)家族中的PPIs 與蛋白質同源二聚和異源二聚現象之間的聯系, 檢測了144 對可能存在的PPIs, 最終發現9 種SNX-BAR 蛋白質間相互作用對同源二聚現象有重要調節作用, 7 種蛋白質相互作用對與異源二聚現象有重要聯系.

AlphaScreen 是一種多功能且靈敏度高的技術, 可進行高通量篩選[41].相比于其他技術,AlphaScreen 具有以下優勢: ①對比能量傳輸距離為10 nm 的FRET 技術, AlphaScreen 為200 nm, 可以研究更大范圍的分析物, 如全長的蛋白質或免疫復合物; ②具有更大的親和力檢測范圍,KD值范圍可以從pmol/L 到mmol/L.但是, 每種類型的微珠都有一定的容量, 過量的靶蛋白會使供體微珠或受體微珠過飽和并抑制它們的結合, 導致信號減弱.因此, 事先進行交叉滴定分析來確定合適的蛋白濃度對于AlphaScreen 方法是必不可少的.

2.3 蛋白質片段互補分析

蛋白質片段互補分析(protein-fragment complementation assay, PCA)技術是近年來發展起來的一種研究蛋白質-蛋白質相互作用的重要策略之一, 可以在體內外動態地觀察活細胞、器官, 甚至個體水平蛋白質間的相互作用[42], 也可以實時定量動態反映復合物的組裝與解離過程.PCA 技術的原理(見圖2(c))是將某個功能蛋白質切成兩段, 分別與兩種興趣蛋白質相連形成兩個融合蛋白質, 若兩個興趣蛋白質存在相互作用使得兩個功能蛋白質片段相互靠近, 互補并重建功能蛋白質的活性, 通過檢測功能蛋白質的活性進而判斷興趣蛋白質間的相互作用關系.在PCA 體系中功能蛋白質的兩個片段相互融合即形成報告蛋白.目前,PCA 所使用的報告蛋白包括二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)[43]、β-內酰胺酶(β-lactamase)[44]、GFP[45]和熒光素酶[46]等.PCA 技術的優點是具有高靈敏度、可定量檢測、可進行高通量篩選, 缺點是融合蛋白的使用有可能會改變興趣蛋白的折疊和結構.

基于DHFR 的PCA 方法的原理是DHFR 可以催化二氫葉酸還原成四氫葉酸, 四氫葉酸對細胞的生長和增殖至關重要, 缺失會致死, 因此DHFR 成為極佳的報告蛋白(report protein)應用于PCA 的研究.這種簡單的生存選擇測定法被廣泛用作大規模分析的系統方法.Rochette等[47]利用DHFR-PCA 的方法研究酵母全局組織的PPIs 網絡對于環境擾動的響應,高通量篩選了正常狀態和藥物誘導DNA 損傷兩種情況下的1 000 多種PPIs, 最終發現156 種PPIs 在對DNA 損傷響應的調節中具有重要作用.

基于熒光蛋白質的PCA 方法也稱為雙分子熒光互補(bimolecular fluorescent complimentary, BiFC), 由于發色團的形成不可逆, 該方法更有利于捕獲蛋白質間的弱相互作用, 并且能夠在高空間分辨率的條件下直接觀察到生物體和各種細胞類型的任何亞細胞區室中的PPIs.新發展的GFP 三裂法, 可以最大程度避免傳統分裂GFP 方法中遇到的聚集和折疊干擾問題[48].但是與其他報告蛋白相比, 基于熒光蛋白的PCA 不適用于定量化研究,僅能作為定性研究.BiFC 技術最大的缺陷是對溫度敏感, 當溫度高時, 片段間不易互補形成完整的熒光蛋白.

2.4 親和層析

親和層析(affinity chromatography, AC)一般指親和色譜.親和色譜法是常見的蛋白質-蛋白質相互作用研究方法, 它是基于蛋白質分子之間高度特異性相互作用將特定蛋白質從復雜的混合物中分離純化出來[10].這種方法極大地提高了蛋白質純化效率, 為蛋白質-蛋白相互作用研究提供技術平臺.親和色譜法包括拉下法、串聯親和純化和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)法等.

(1) 拉下(pull-down)法.拉下法是研究蛋白質-蛋白質相互作用強大技術之一, 原理是將GST 融合的誘餌蛋白質固定在谷胱甘肽固相載體上, 用以捕獲與之相互作用的目標蛋白質,然后洗脫結合物并通過SDS-PAGE 電泳分析鑒定(見圖2(d)).拉下法可用于研究可疑或未知的PPI.Luo等[49]對拉下法進行改進, 提出一步胰蛋白酶裂解洗脫法來研究鳥苷三磷酸酶(GTPase)Rab31 與EEA1 間的相互作用, 有效地減少假陽性和假陰性現象.Schulte等[50]研究了一種SINBAD 微型拉下法用于檢測PPI, 通過熒光顯微鏡觀察單個親和層析磁珠表面親和標記的興趣蛋白質與不同顏色量子點標記的蛋白質之間的結合, 這種方法可以同時分析多組PPIs, 減少實驗所需的時間和材料.

(2) 串聯親和純化(tandem affinity purification, TAP)法.TAP 法采用兩步親和純化(見圖2(e)), 能夠快速研究在生理條件下蛋白質的相互作用.TAP 法可以提高特異性, 有效減少非特異性結合, 大大降低結果的假陽性率.例如, 鼠傷寒沙門氏菌通過三型分泌系統(type 3 secretion system, T3SS)向宿主傳遞效應蛋白質SopA, 刺激腸上皮引發炎癥反應.Kamanova等[51]在SopA 上融合表達GST 和flag 兩個標簽, 通過TAP 體外純化, 質譜分析鑒定, 確定與SopA 相互作用的兩個E3 泛素連接酶TRIM56 和TRIM65.進一步研究發現,SopA 與這兩個蛋白質結合后, 通過兩個先天免疫受體MDA5 和RIG-Ⅰ來刺激宿主的免疫信號.這一研究揭示了沙門氏菌可以通過直接作用于宿主先天免疫信號通路來調節免疫反應的沙門氏菌作用機制.但是, TAP 法不容易檢測到弱的蛋白質-蛋白質的相互作用.

(3) Co-IP 法.免疫共沉淀法被廣泛應用于PPIs 的研究中, 是確定生理狀態下細胞內PPI 的有效方法.其原理是以抗原抗體之間的專一性為基礎, 將蛋白質復合物沉淀在固相載體上, 再通過蛋白質變性分離, 檢測結合蛋白質, 進而證明蛋白質間的相互作用(見圖2(f)).Co-IP 方法研究自然狀態下的PPI, 避免人為干擾, 可信度高, 但不易檢測親和力較弱的PPIs.Fedosejevs等[52]利用該技術研究在蓖麻油籽中SUS 與RGP 間的相互作用, 使用抗體蔗糖合酶1(sucrose synthase-1, RcSUS 1)免疫沉淀蛋白質復合物RcSUS 1 和RcRGP 1, 通過鑒定確定RcSUS 1 與RcRGP 1 間存在明顯相互作用, 進而證明了在植物的發育種子和根中SUS與RGP 通過相互作用, 促進源自蔗糖的UDP-葡萄糖用于半纖維素和糖蛋白的生物合成, 為SUS-RGP 代謝物提供證據.這一結果有助于更好理解種子中碳代謝和光合產物的分配, 在代謝工程中具有潛在應用價值.

3 結束語

近年來表征蛋白質-蛋白質相互作用的新技術、新方法不斷涌現, 并向高靈敏度、高通量的方向發展.根據研究目標的不同以及蛋白質自身的特點, 選擇合理的檢測方法十分重要.若要定性表征蛋白質分子間是否存在相互作用, 可以選擇傳統的拉下法、TAP、Co-IP 等方法進行檢測; 若要定量測量蛋白質分子間的相互作用, 可以選擇MST, SPR, PLI 等方法進行檢測;若要進行高通量的研究, 可以選擇FRET, AlphaScreen, PCA 等方法進行檢測.所有方法都有其自身的局限性, 可能在檢測中出現假陽性或假陰性的結果.因此, 應該使用基于不同原理的技術方法相互驗證, 以獲得更為可靠的結果.同時, 不同技術方法的聯用可彌補單種技術的不足.例如, 借助質譜的高靈敏度、高通量的優勢, 親和層析可以與質譜(mass spectroscopy,MS)聯用(即AP-MS)鑒定與目標蛋白質相互作用的蛋白質, 以獲得更完整的信息.隨著技術方法的持續進步, 在蛋白質-蛋白質相互作用研究領域將會更廣泛地應用上述技術.預計檢測蛋白質-蛋白質相互作用的技術將向高通量方向發展, 并將會產生大量的實驗數據, 因此需要發展更強大的生物信息處理工具將原始數據轉化成有用的信息.