生脈飲“異病同治”糖尿病和心力衰竭的網絡藥理學作用機制研究

王旭杰，張菀桐，王妙然，李秋艷，指導：翁維良

中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091

生脈飲由人參、麥冬、五味子組成，出自金元時期張元素《醫學啟源》，主治溫、暑熱邪所致耗氣傷陰或久咳傷肺，津液外泄等氣陰兩虛證。方中人參甘溫，為君藥，歸脾、肺、心、腎經，大補元氣、生津養血、益智安神；麥冬甘寒，為臣藥，歸心、肺、胃經，滋陰生津、清心潤肺；五味子酸溫，為佐藥，歸肺、心、腎經，益氣生津、收斂固澀、寧心補腎。三藥合用，一補一潤一斂，共奏補益氣陰、生津止渴、斂陰止汗之功[4]。《醫方集解》云：“人有將死脈絕者，服此能復生之，其功甚大。”目前，生脈飲在傳統散劑、湯劑的基礎上采用現代技術開發出注射液、口服液等新劑型，主治范圍十分廣泛，臨床常用于治療慢性支氣管炎、肺結核、冠心病、心力衰竭、心律失常、糖尿病等[5]。實驗研究表明，生脈飲加減及其各類制劑可能通過抗氧化自由基產生，阻斷高血糖和糖化終末產物，從而抑制系膜細胞增殖、非酶糖化反應及胰島細胞凋亡與壞死等機制起到降低血糖的作用[6-8]，并且通過抑制心肌細胞凋亡、擴張冠狀動脈、提高心肌缺氧耐受性、減慢心室重構、增強心臟泵血功能、降低腎素活性及增加心力衰竭患者內源性洋地黃物質血清水平等機制改善心功能，抗心肌缺血缺氧，從而達到防治心力衰竭的目的[9-12]。本研究采用網絡藥理學方法，從“異病同治”角度系統探討生脈飲治療糖尿病和心力衰竭的作用機制。

1 資料與方法

1.1 生脈飲活性化合物收集與篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[13]對人參和五味子主要化合物成分的藥物動力學性質進行評估。選擇“Herb Name”，分別以“人參”“五味子”作為關鍵詞，選取口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 的化學成分作為候選活性成分。在BATMAN-TCM 數據庫（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中以“麥冬”為關鍵詞，設置“藥物-靶點”模型相似性閾值（score cutoff）≥20 和P≤0.05，檢索篩選麥冬活性成分。通過PubChem 平臺（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.ov/）對活性化合物分子結構進行確證，統一導入.xls 文檔。

1.2 生脈飲潛在靶點預測

利用UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/）對所得化合物進行檢索和轉化操作，找出生脈飲各組分的基因靶點。采用UniProt 數據庫的UniProtKB 搜索功能，輸入蛋白名稱（protein name）并限定物種為人（homo sapiens），將檢索得到的所有蛋白校正為其官方名稱（official symbol）并摘錄標準基因名，獲取正確的靶點信息。

1.3 糖尿病和心力衰竭靶點收集

通過 DisGeNET（http://www.disgenet.org/）和GeneCards（https://www.genecards.org/）數據庫收集糖尿病和心力衰竭的相關靶點，輸入關鍵詞“Heart Failure”“Diabetes Mellitus”，獲得已報道與糖尿病和心力衰竭相關的靶點，去除重復基因和假陽性基因，將上述生脈飲活性成分靶點與疾病相關靶點匹配取交集，分別獲得生脈飲治療糖尿病和生脈飲治療心力衰竭的作用靶點。

1.4 共有靶點網絡構建與蛋白相互作用網絡分析

分別將人參、五味子、麥冬的有效成分和作用靶點信息與糖尿病和心力衰竭的靶點信息導入Cytoscape3.6.1 軟件，采用該軟件的Merge 功能分別篩選出生脈飲藥物成分對糖尿病和心力衰竭的作用靶點（基因）。

將篩選出的共同作用靶點（基因）與富集得到的通路作為網絡的節點（node），以.xls 文檔中建立的相互對應關系作為網絡的連接（edge），導入String 數據庫（https://string-db.org/），進行蛋白相互作用（PPI）網絡構建與數據分析，利用 Cytoscape3.6.1 的CentiScaPe 插件進行網絡相互作用分析，使用CytoNCA 插件篩選度值較高的靶點。通過有效成分-靶點網絡圖分析生脈飲治療糖尿病和心力衰竭的作用靶點，并明確藥物與通路之間的協同作用。

“自我”處于“本我”和“超我”之間，位于人格金字塔的中間層，對于“本我”和“超我”起著調節作用，換句話說“自我”是“本我”和“超我”的平衡者，是自己意識的存在和覺醒。瑪麗有著支離破碎的“本我”和病態發展的“超我”，導致其在各個階段表現出來的都是迷失的“自我”。

1.5 KEGG 通路與GO 功能富集分析

Cytoscape 軟件的插件ClueGo[14]整合了KEGG 信號通路分析相關數據。本研究分別采用ClueGO 和DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）對關鍵靶點進行KEGG 信號通路和GO 功能富集分析，研究生脈飲治療糖尿病和心力衰竭可能靶點的關鍵通路和生物學過程。

2 結果

2.1 生脈飲活性化合物及潛在靶點

通過TCMSP 分別檢索到人參、五味子小分子化合物190、130 個，以OB≥30%、DL≥0.18 為條件分別篩選出具有較高活性的化合物22、8 個，去除重復化合物，共29 個。通過BATMAN-TCM 數據庫篩選得到麥冬活性成分22 個，排除無靶點信息的化合物，最終篩選出18 個有效化合物。

考慮化合物含量、代謝及藥理作用，對生脈飲有效化合物進行補充。人參、五味子為生脈飲的君藥、佐藥，其主要成分分別為人參皂苷類、五味子素類，通過文獻檢索兩藥治療糖尿病和心力衰竭的有效成分，在已選取化合物基礎上，加入3 個人參相關化合物Ginsenoside Rb1、Ginsenoside Rb2、Ginsenoside Re，以及1 個五味子相關化合物Schisandrin。去除重復化合物，共獲得50 個小分子化合物。通過UniProt 數據庫對所得化合物經過檢索和轉化操作，得到生脈飲有效成分的基因靶點共3754 個。

2.2 生脈飲治療糖尿病和心力衰竭相關靶點

通過DisGeNET 和GeneCards 數據庫搜索得到糖尿病特異疾病靶點1506 個、心力衰竭特異靶點814個，選取評分值≥0.1 的相關度較高的基因，得到糖尿病特異性靶點218 個、心力衰竭特異性靶點317 個。將生脈飲各藥物成分靶點分別與2 種疾病相關靶點取交集，獲得生脈飲治療糖尿病和心力衰竭的作用靶點，其中生脈飲治療糖尿病的作用靶點109 個，生脈飲治療心力衰竭的作用靶點196 個。

2.3 活性成分-靶點網絡分析

2.3.1 生脈飲治療糖尿病成分-靶點網絡分析

運用Cytoscape3.6.1 軟件構建生脈飲活性成分治療糖尿病潛在作用靶點網絡，包含133 個節點（21個活性成分、112 個作用靶點）和170 條邊，見圖1。

將生脈飲治療糖尿病的靶點導入String 平臺進行PPI 網絡分析，結果見圖2。該網絡有109 個節點蛋白，1435 條相互作用連線，線條粗細代表作用強弱。利用Cytoscape3.6.1 軟件的CentiScaPe 插件計算出平均度值為26.3，平均節點中心性為0.005，平均中介中心度為92.4。使用CytoNCA 插件篩選出度值居前10 位的靶點，分別為INS、IL6、ALB、TNF、PPARG、TP53、LEP、VEGFA、CAT、IGF1，表明這10 個靶蛋白是PPI 網絡中最關鍵的靶點，在該網絡中發揮重要作用，是生脈飲治療糖尿病的主要藥效靶點。

圖1 生脈飲治療糖尿病成分-靶點網絡圖

2.3.2 生脈飲治療心力衰竭成分-靶點網絡分析

運用Cytoscape3.6.1 軟件構建生脈飲治療心力衰竭潛在作用靶點網絡，見圖3。該網絡包含218 個節點（19 個活性成分和199 個作用靶點）和270 條邊。

將生脈飲治療心力衰竭的靶點導入String 平臺進行PPI 網絡分析，結果見圖4。該網絡有196 個節點蛋白，2665 條相互作用連線，線條粗細代表作用強弱。利用Cytoscape3.6.1 軟件的CentiScaPe 插件計算出平均度值為27.2，平均節點中心性為0.003，平均中介中心度為196.9。使用CytoNCA 插件篩選出度值前10的靶點，分別為INS、IL6、ALB、TNF、VEGFA、TP53、NOS3、PPARG、IGF1、CCL2，表明這10 個靶蛋白是PPI 網絡中最關鍵的靶點，在該網絡中發揮重要作用，是生脈飲治療心力衰竭的主要藥效靶點。

圖2 生脈飲治療糖尿病PPI 網絡圖

圖3 生脈飲治療心力衰竭成分-靶點網絡圖

圖4 生脈飲治療心力衰竭PPI 網絡圖

2.4 共有靶點KEGG 通路和GO 功能富集分析

2.4.1 生脈飲治療糖尿病靶點KEGG通路和GO功能富集分析

生脈飲治療糖尿病靶點KEGG 通路分析結果見圖5。AGE-RAGE 信號通路、胰島素抵抗信號通路、腎素分泌信號通路、脂肪細胞脂解調控信號通路、癌癥通路、肌萎縮側索硬化信號通路、膽固醇代謝信號通路、青春晚期糖尿病信號通路及PPAR 信號通路在生脈飲治療糖尿病過程中發揮了重要作用。其中AGE-RAGE 信號通路、胰島素抵抗信號通路、腎素分泌信號通路占比最高，預測生脈飲對這3 條通路的調節在糖尿病治療中具有重要作用。

將生脈飲治療糖尿病的109 個靶點信息導入DAVID 數據庫進行GO 功能富集分析，生物過程部分結果見表1。穩態過程（43 個靶點）、體內化學平衡（37 個靶點）、激素刺激應答（28 個靶點）、內源性刺激應答（28 個靶點）、有機物應答（35 個靶點）排列靠前，同時還與細胞增殖調控、脂質代謝過程的正向調控、對細胞外刺激的反應等生物過程有關。

表1 生脈飲治療糖尿病GO 功能分析生物過程部分結果

2.4.2 生脈飲治療心力衰竭靶點KEGG通路和GO功能富集分析

生脈飲治療心力衰竭靶點KEGG 通路分析結果見圖6。鈣離子信號通路、白細胞介素17 信號通路、粘著斑信號通路、萎縮側索硬化信號通路、Apelin 信號通路、HIF-1 信號通路、受體相互作用信號通路、胰島素抵抗信號通路、AGE-RAGE 信號通路、cAMP信號通路及Relaxin 信號通路等在生脈飲治療心力衰竭過程中發揮重要作用。由于各通路所占百分比差距并不明顯，故通過文獻研究從中選取3 條主要通路探尋生脈飲治療心力衰竭的主要機制。

圖6 生脈飲治療心力衰竭KEGG 通路餅狀圖

將生脈飲治療心力衰竭的196 個靶點信息導入DAVID 數據庫進行GO 富集分析，生物過程部分結果見表2。循環系統過程（41 個靶點）、血液循環（41個靶點）、系統過程調節（48 個靶點）、穩態過程（65個靶點）、化學穩態（53個靶點）排列靠前，同時還與血壓調節、多細胞生物過程的負調節、細胞增殖調控等生物學過程有關。

表2 生脈飲治療心力衰竭GO 功能分析生物過程部分結果

3 討論

中藥復方成分復雜，其藥效團與作用機制一直是研究的難點。生脈飲作為中醫經典名方，臨床治療作用廣泛，方中人參、麥冬、五味子亦是臨床使用頻次甚高的藥物。臨床研究表明，在西醫治療基礎上，以生脈飲為底方進行加減可更有效控制氣陰兩虛型糖尿病患者的血糖，且整體療效確切，安全性高[15-166]。在西醫常規治療基礎上，給予生脈注射液或生脈飲口服液可提高心力衰竭患者的心輸出量和左室射血分數，并對改善心功能分級具有潛在益處[177]。

本研究采用網絡藥理學方法對生脈飲組方藥物活性成分及其對應靶點進行預測，并經文獻查閱與所得數據分析對比，發現生脈飲可能主要通過調節AGE-RAGE 信號通路、胰島素抵抗信號轉導通路、腎素分泌信號通路、鈣離子信號通路、HIF-1 信號通路及Relaxin 信號通路等對糖尿病、心力衰竭及糖尿病合并心力衰竭達到治療效果。因此，對以上幾個主要通路的分析尤為關鍵。

AGE-RAGE 信號通路參與了糖尿病、腫瘤、神經性疾病等多種疾病的發生。晚期糖基化終產物（AGEs）是多種物質的總稱，由于人體長期處于高血糖狀態下，葡萄糖分子與體內蛋白質發生非酶糖基化反應最終形成AGEs。AGEs 可引起不同程度的胰島β 細胞功能障礙[18]或細胞凋亡[19]，流行病學研究顯示，AGEs 與胰島素原/胰島素存在正相關性[20]，直接提供了人群證據表明AGEs 是一種導致糖尿病發生的獨立致病因素。當AGEs 與細胞表面特異性信號傳導受體RAGE 結合后，還可誘導發生氧化應激反應，產生自由基，導致氧化損傷、血管收縮和促凝血狀態，促進糖尿病的發生和發展[21]。AGE-RAGE 信號通路亦在心力衰竭發生、發展過程中起一定作用。有研究推測機體高濃度AGEs 可能引起心力衰竭，RAGE是介導AGEs 對心血管系統引起損害反應的主要受體，二者結合可增加心肌細胞的凋亡率[22]。當心肌細胞受損，RAGE 表達增加，與AGEs 結合后可阻礙鈣離子代謝、血管收縮、心肌纖維化等，從而導致心肌收縮舒張功能障礙[23]。

胰島素抵抗信號轉導通路是由于炎性細胞因子升高，干擾胰島素信號轉導中胰島素受體底物的正常磷酸化，阻斷下游靶點激活而形成[24]。胰島素抵抗是2 型糖尿病重要的生理病理機制，并且可以通過影響能量代謝、神經內分泌等多個途徑導致心力衰竭，使心血管事件發生率增加[25]。

腎素血管緊張素系統與多種疾病的病理生理過程關系緊密，包括腎臟疾病、心血管疾病、糖尿病等。腎素和醛固酮是2 型糖尿病的關鍵催化因子，通過一系列酶促級聯反應在糖尿病的發生發展中扮演重要角色[26]，而血糖濃度過高又可直接引起腎小球足突細胞的腎素分泌[27]。對于嚴重心力衰竭患者，腎素作用于血管緊張素原，生成血管緊張素，激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統，導致血管收縮、血壓上升，加重心臟負擔。

鈣離子信號通路是心力衰竭發生發展的中心環節[28]。Ca2+在心肌的收縮和舒張過程中起著極為關鍵的作用，肌質網內Ca2+濃度下降，引起心肌收縮力減弱，促進心力衰竭發生，而心力衰竭心臟的電生理特性和收縮功能的改變均與心肌舒張過程中心肌細胞內Ca2+延遲升高有關。鈣離子通道與胰島素分泌關系密切，Ca2+是胰島素釋放的重要信號。當血糖升高時，導致胰島β 細胞中Ca2+水平升高，從而觸發胰島素釋放，當細胞無法釋放正常水平的胰島素時，此機制就會受到影響。

缺氧誘導因子（HIF）信號通路涉及廣泛，已知可調節數以百計的基因表達，在多種心血管疾病、炎癥、癌癥與急性臟器損傷等過程中發揮重要作用[29]。其中，HIF-1 蛋白能夠促進血管新生、改善無氧代謝、增強免疫應答、促進紅細胞生成以及維持內環境穩態。血管內皮生長因子（VEGF）是HIF-1 最典型的靶基因，心肌缺血后，HIF-1 調控VEGF 的表達，促進心肌中血管生成，改善心肌供血供氧，對心肌組織側支循環的建立有重要意義[30]。而在心力衰竭晚期，HIF-1α 長期慢性表達則會加重壓力超負荷所致的心肌重構和心力衰竭，增強對心臟的惡化作用[31]。另有實驗研究表明，糖尿病會影響HIF-1 活性，導致眾多下游靶基因表達減少或功能減退，影響血液循環并導致傷口愈合障礙[32]。

松弛素信號轉導通路的激活是由松弛素與其受體結合后，受體發生構象改變，細胞外片段末端與跨膜亞單位發生作用而產生的[33]。松弛素由心臟分泌釋放，對心血管事件的預后具有預測作用，尤以嚴重的心力衰竭最為顯著[34]，并具有舒張血管、抗心肌重構、抗心肌缺血、抗炎等作用[35]。臨床研究表明，松弛素有利于緩解急性心力衰竭和呼吸困難等臨床癥狀，具有良好的安全性和耐受性[36]。另有數據顯示，外源性松弛素給藥可改善糖尿病患者的胰島素敏感性，科學界正在探索松弛素在糖尿病及其并發癥中可能的有益作用[37]。

本研究通過對有效靶點進行KEGG 通路分析發現，生脈飲主要通過調控AGE-RAGE 信號通路、胰島素抵抗信號通路、腎素分泌信號通路等通路治療糖尿病，通過調控鈣離子信號通路、缺氧誘導因子信號通路及松弛素信號轉導通路等通路治療心力衰竭，而調節上述各通路對糖尿病和心力衰竭及二者共病均有相應的調控作用。可以看出，生脈飲作用范圍十分廣泛，且能通過不同的調節方式對相應信號通路產生作用而達到對某類疾病的干預目的。筆者認為，生脈飲對信號通路的調節十分復雜，可能通過激素、細胞代謝、炎癥及免疫因子等多種信號通路作用于糖尿病和心力衰竭。另外，本研究尚未對麥冬多糖、五味子多糖等大分子復合成分及有待發掘的藥效團進行分析，因此，對于何種成分以何種方式作用于具體靶基因及各通路調節機制等應繼續深入研究。基于網絡藥理學的作用機制探索為治療糖尿病與心力衰竭提供了重要線索，同時可為中醫“異病同治”機制研究提供新的探索方向。