針刺對SAMP8 小鼠海馬線粒體SIRT3 調控因子GATA-2 表達的影響

種文強，張慧葉，王夢靜，李昂，邢文文，王強，趙嫻，喬海法，楊曉航，劉奇

陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046

阿爾茨海默病（Alzhermer disease，AD）多發生于老年人，是一種以進行性記憶力喪失、認知功能損害、行為異常和社交障礙為臨床特點的神經退行性疾病[1]。近年來隨著AD 研究的深入，其能量代謝機制引起了廣泛關注。線粒體作為細胞最主要的能量來源，大腦的高能量需求對能量供給和線粒體功能的變化非常敏感，使線粒體功能障礙及氧化應激成為AD病理過程的關鍵環節之一。Sirtuins 家族是一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性的組蛋白去乙酰化酶，1979 年首次由Rine 等[2]在酵母內發現，被命名為“沉默信息調控因子2（SIR2），SIRT3 作為Sirtuins家族的一員[3-4]，主要定位于線粒體[5]，具有促進機體能量生成和線粒體自噬發生、保護線粒體功能、提升線粒體生物合成能力、增強線粒體動力學變化等作用[6]。但SIRT3 的轉錄與表達受到諸多因素調控，其中調控轉錄因子GATA-2 具有調節AD 中差異表達基因的功能[7]；而在SIRT3 基因的內含子上，存在著可變數目的串聯重復序列（variable number of tandem repeat，VNTR），它具有增強子活性，并可增加SIRT3表達[3]。轉錄因子GATA-2 和c-Jun/c-Fos 過表達，可增強SIRT3 的VNTR 增強子活性[8]，從而增強SIRT3的表達及生物學功能。針刺從能量代謝角度治療AD療效已得到廣泛認可，主要體現在改善線粒體超微結構、調節細胞內鈣穩態、阻滯通透性轉換孔形成、改善線粒體動力學等方面[9]，但其機制迄今尚未十分明了。百會為督脈和手足三陽經、足厥陰經之交會穴，具有補益腦髓、通竅醒神功效；涌泉上承足太陽膀胱經之陽，下合于足少陰腎經之陰，可交通陰陽氣血、開竅醒神。二穴相合，遠道取穴結合局部選穴，上下貫通，連接病位與臟腑，具有養腎精、通腦竅、祛邪毒、化濁氣、治療癡呆功效。基于AD 腎虛髓空的病機，本實驗選取“百會”“涌泉”，觀察針刺對SAMP8小鼠海馬線粒體SIRT3 調控因子GATA-2 表達的影響，進一步從保護線粒體、調節能量代謝的角度揭示針刺防治AD 的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SAMP8 小鼠27 只，SAMR1 小鼠9 只，6 月齡，雄性，體質量（30±5）g，購于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，動物許可證號 SCXK（京）2019-0008。飼養于陜西中醫藥大學針藥結合創新中心實驗室動物房，溫度（22±2）℃，相對濕度40%～60%，光照12 h，自由攝食飲水，單籠飼養。適應性飼養7 d，采用水迷宮實驗剔除運動或感覺障礙對空間學習記憶有影響的小鼠，并將符合實驗要求的SAMP8 小鼠按隨機數字表法隨機分為模型組、針刺組、抑制劑組各9 只，9 只SAMR1 小鼠作為空白組。

1.2 試劑

Anti-GATA-2 antibody，艾博抗（上海）貿易有限公司，批號Ab 173817；Trizol，寶日醫生物技術（北京）有限公司，批號9108-1；3-TYP，MCE 中國公司，批號HY- 108331；反轉錄試劑盒，寶日醫生物技術（北京）有限公司，批號 639549；Anti β-tubulin Mouse Monoclonal Antibody，北京康為世紀生物科技有限公司，批號CW0098；PVDF（0.45 μm），上海索萊寶生物科技有限公司，批號HY- 108331；DAB 顯色試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司，批號AR1178；ECL化學發光即用型底物，上海碧云天生物技術有限公司，批號AR1197；PrimeScripTMRT reagent Kit，寶日醫生物技術（北京）有限公司，批號 RR014A；Hoechst33342，Invitrogen 公司，批號 H1399；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司，批號AR0138。

1.3 儀器

ChemiDoc MP-Bio-Rad 凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司，型號SYSTEM GelDoc XR+），勻漿機（鄭州南北儀器設備有限公司，型號XHF-D），高速冷凍離心機（日本日立公司，型號CR22G），全自動酶標儀（美國Bio-Rad 公司，型號IMARK），濕轉槽（美國Bio-Rad 公司，型號175-8001），高電流電泳儀PowerpacTMHc（美國Bio-Rad 公司，型號1645050），手壓塑料封接機（南浦豐奇包裝廠，型號F-200），干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，型號WGLL-65BE），轉輪式切片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，型號KD-2268），自動脫水機（金華市科迪儀器設備有限公司，型號KD-TS3A），組織冷凍包埋機（金華市科迪儀器設備有限公司，型號KD-BM），恒溫水浴鍋（常州德歐儀器制造有限公司，型號HH-SI），PCR 儀（美國Bio-Rad 公司，型號T100），Morris 水迷宮視頻分析系統（上海吉量軟件科技有限公司，型號JL-MWMG），0.25 mm×13 mm 華佗牌一次性針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司）。

1.4 干預

針刺組和抑制劑組針刺“百會”“涌泉”，“百會”向前平刺2 mm，“涌泉”向腳踝方向斜刺2 mm，雙側穴位隔日交換。進針后，施以捻轉平補平瀉，5 min行針1 次，留針20 min。每日1 次，5 d 為1 個療程，每個療程結束后休息2 d，治療4 個療程。針刺療程結束后，水迷宮實驗期間第1、3、5、7 日按50 mg/kg劑量給予抑制劑組腹腔注射SIRT3 抑制劑3-TYP，針刺組注射與抑制劑組等體積生理鹽水。空白組和模型組不做任何干預。上述措施均在小鼠清醒狀態下由固定實驗人員用自制小鼠固定器進行抓取和固定。

1.5 取材

末次水迷宮實驗結束后，各組隨機選取小鼠5 只。2%戊巴比妥（0.2 mL/100 g）麻醉動物后頸椎脫臼處死，冰上剝離海馬，左側用于Western blot 檢測，稱重后過液氮，置于凍存管；右側用于RT-PCR 檢測，置于無RNA 酶管過液氮并移至-80 ℃冰箱保存。余每組4 只小鼠，2%戊巴比妥麻醉并固定，剪開腹部及胸骨左側肋骨，暴露心臟，經左心室用50 mL 針管緩慢灌注20 mL 生理鹽水（預冷），同時助手剪開右心耳，待右心耳流出液澄清無血液且肝和肺顏色變白再行灌注4%多聚甲醛（pH 7.4，4 ℃預冷）40 mL 固定腦組織直至小鼠后肢繃直，斷頭快速取腦，4%多聚甲醛（預冷）固定24 h，25%蔗糖溶液4 ℃過夜脫水，減少冰晶，OCT 包埋，冰凍切片機切片（10 μm），緩沖液中浸泡，-20 ℃冰箱保存，染色備用。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 Morris 水迷宮實驗

參照Vorhees 等[10]推薦的水迷宮實驗方案進行，依次為4 d 可視平臺實驗、3 d 定位航行實驗和1 d 空間探索實驗，共計8 d，治療后各實驗再進行1 次。將水池平分為4 個象限（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），放置三角形（綠色）、圓形（黃色）、正方形（藍色）、星形（紅色）標記予以區分。水溫18～22 ℃，逃生平臺放入第Ⅱ象限，其中可視平臺高于水面2 cm，定位航行平臺低于水面2 cm。第1～4 日為可視平臺實驗，將小鼠從每個象限固定點輕放入水，逃避潛伏期設為60 s，記錄小鼠自開始游泳至到達逃生平臺并成功停留3 s 所需時間，記作本次實驗逃避潛伏期。如果60 s內未找到平臺，當次逃避潛伏期計60 s，由實驗者引導其爬上平臺，在平臺上停留并熟悉15 s 后開始下一個象限。將4 次逃生平臺潛伏期均值作為該小鼠當日逃避潛伏期。每只小鼠每日每個象限各測定1 次，完成4 次航行實驗后，擦干小鼠毛發放回籠內，實驗結束后剔除視覺、感覺和運動能力障礙的動物。第5～7日為定位航行實驗，逃生平臺低于水面2 cm，操作同可視平臺，記錄動物實驗中的運動軌跡、逃避潛伏期及總路程。第8 日為空間探索實驗，撤去逃生平臺，其余操作同可視平臺，計算動物游泳路程和穿越平臺次數，并記錄目標象限時間，每個象限各進行1 次，共4 次，平均值作為當日成績。

1.6.2 RT-PCR 檢測轉錄因子GATA-2 mRNA 表達

Trizol 提取凍存海馬總RNA。用Prime-Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉錄得cDNA。按熒光定量試劑盒說明書配制反應體系。程序：94 ℃、4 min，94 ℃、30 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s（30 個循環）；72 ℃、10 min，短期貯存-4 ℃，長期貯存-20 ℃。具體步驟參考TaKaRa 公司說明書。RT-PCR 數據處理采用相對定量法，以GAPDH 為內參基因，采用2-ΔΔCt法分析相應指標的mRNA 相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR 引物序列

1.6.3 免疫熒光檢測GATA-2 蛋白表達

切片室溫晾干，0.01 mol/L PBS 清洗3 次×5 min，均勻涂滴腦片上，封閉30 min；吸棄封閉液，0.01 mol/L PBS 浸洗3 次×10 min；用含3%BSA 及0.03%TritonX-100 的抗體稀釋液稀釋相應的一抗至合適濃度，使腦片完全浸入液體，4 ℃過夜孵育；吸棄一抗稀釋液，0.01 mol/L PBS 清洗10 min×3 次；按比例配制熒光二抗，室溫避光孵育2 h；二抗孵育結束后，0.01 mol/L PBS 清洗10 min×3 次；加入Hoechst33342襯染細胞核，室溫避光孵育10 min，0.01 mol/L PBS清洗10 min×3 次，晾干，50%甘油-PBS 溶液封片（甘油∶PBS＝9∶1），4 ℃冰箱避光保存；熒光顯微鏡下拍照。

1.6.4 Western blot 檢測GATA-2 蛋白表達

-80 ℃冰箱取出冰凍海馬組織置于冰上，待其融化后移至1.5 mL 離心管，加入RIPA 蛋白裂解液，置于預先準備的含碎冰的小燒杯內勻漿，勻漿10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清，-20 ℃保存。采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。根據結果計算上樣量。5×loading buffer 按1∶5 比例加入配制好的蛋白樣品，95 ℃金屬浴10 min 使蛋白變性。制膠、電泳、轉膜。PVDF 膜浸泡在40 mL 含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫封閉2 h，將膜和稀釋好的一抗裝入封閉袋中，4 ℃搖床過夜。一抗孵育結束后用TBST 洗3 次×10 min。二抗室溫孵育2 h，結束后洗滌方法同封閉，配制發光液，并與膜進行充分反應，于Bio-Rad 發光儀下進行曝光拍照，Image J 軟件定量分析電泳條帶的蛋白表達量。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 針刺對SAMP8 小鼠Morris 水迷宮實驗學習記憶能力和逃避潛伏期的影響

4 組小鼠可視平臺實驗3 d 平均游泳總路程差異無統計學意義（P＞0.05），表明4 組小鼠視覺、運動能力等對水迷宮實驗結果無影響，見表2。與空白組比較，模型組小鼠平均逃避潛伏期明顯延長，其中水迷宮實驗第4、5、7 日差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），小鼠穿越平臺次數顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，針刺組小鼠第4、7 日平均逃避潛伏期明顯縮短，針刺組小鼠穿越平臺次數顯著增加，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與針刺組比較，抑制劑組小鼠第6 日平均逃避潛伏期明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3、表4。

表2 各組小鼠可視平臺實驗游泳總路程比較（，mm）

表2 各組小鼠可視平臺實驗游泳總路程比較（，mm）

表3 各組小鼠定位航向實驗逃避潛伏期比較（，s）

表3 各組小鼠定位航向實驗逃避潛伏期比較（，s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，☆P＜0.05；與針刺組比較，#P＜0.05

表4 空間探索實驗各組小鼠穿越平臺次數比較（）

表4 空間探索實驗各組小鼠穿越平臺次數比較（）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，☆☆P＜0.01

2.2 針刺對SAMP8 小鼠海馬線粒體SIRT3 調控因子GATA-2 mRNA 表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠海馬SIRT3 調控因子GATA-2 mRNA 表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，針刺組小鼠海馬SIRT3調控因子GATA-2 mRNA 表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠海馬線粒體SIRT3 調控因子GATA-2 mRNA 表達比較（）

表5 各組小鼠海馬線粒體SIRT3 調控因子GATA-2 mRNA 表達比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，☆P＜0.05

2.3 針刺對SAMP 小鼠海馬線粒體SIRT3 調控因子GATA-2 蛋白表達的影響

免疫熒光檢測結果：與空白組比較，模型組小鼠海馬SIRT3 調控因子GATA-2 陽性細胞平均表達面積明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組小鼠海馬SIRT3 調控因子GATA-2陽性細胞平均表達面積明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與針刺組比較，抑制劑組小鼠海馬SIRT3 調控因子GATA-2 陽性細胞平均表達面積明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。Western blot 檢測結果：與空白組比較，模型組小鼠海馬SIRT3 調控因子GATA-2 蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組小鼠海馬SIRT3 調控因子GATA-2 蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與針刺組比較，抑制劑組小鼠海馬SIRT3 調控因子GATA-2 蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2、圖3。

圖1 各組小鼠海馬線粒體SIRT3 調控因子GATA-2 陽性細胞表達（免疫熒光，×200）

圖2 各組小鼠海馬線粒體SIRT3 調控因子GATA-2 蛋白免疫印跡圖

圖3 各組小鼠海馬線粒體SIRT3 調控因子GATA-2 蛋白表達比較（，每組9 只）

3 討論

線粒體能量代謝機制作為AD 熱點研究方向之一，近年來取得了一系列重大進展。線粒體三羧酸循環和氧化磷酸化產生的ATP 作為高能量需求器官最重要的能量來源，對維持大腦神經元尤其是海馬神經元的功能完整性（蛋白質降解、離子穩態、囊泡運輸和發射方式）起著重要作用。研究表明，AD 早期線粒體就已出現融合與裂解之間動態平衡的破壞，并伴隨著線粒體數量減少、形態改變[11]，以及線粒體呼吸鏈復合物Ⅳ活性降低所致的活性氧富集、Ca2+吸收過量、酶活性降低等病理改變，最終誘導β-淀粉樣蛋白（Aβ）的形成，而Aβ 進一步誘導線粒體功能障礙、氧化應激，最終造成惡性循環[12]。另外，AD 其他病理標志物也與線粒體功能關系密切，如Tau 蛋白累積可使線粒體功能異常，影響AD 神經元中細胞器的軸突運輸并最終導致神經元功能紊亂。因此，保護線粒體結構，改善其功能，對延緩AD 病理進程、改善AD 患者的臨床癥狀有較大的作用，也是防治AD 的重要研究方向。

SIRT3 作為一種NAD+依賴的蛋白去乙酰化酶，主要定位于線粒體[5]，NAD+豐度的變化可直接影響SIRT3 活性，SIRT3 通過干預與線粒體穩態有關的多種代謝調節劑脫乙酰化參與氧化應激、能量代謝、線粒體功能調節[13]，同時參與電子傳遞鏈和ATP 合成[14]，一定程度上調節細胞的存活、增殖、代謝、死亡和衰老，以及器官的長壽[15]。實驗和臨床研究發現，人腦的嗅皮質、海馬區及白質區SIRT3 表達隨著AD病情的進展不斷減少[16]，SIRT3 的過表達可增加SIRT3 脫乙酰基活性，挽救線粒體功能和被Aβ 破壞的ATP 產生[17]。SIRT3 的轉錄與表達受到許多因素的調控，GATA-2 就是其中重要的轉錄因子之一。

GATA 轉錄因子家族是一類通過與DNA 序列（G/A）GATA（A/T）結合發揮作用的轉錄因子，是進化保守的鋅指蛋白轉錄因子，在不同物種中廣泛表達，對增殖分化及基因調控起非常重要的作用[18]。主要包括GATA-1、GATA-2、GATA-3、GATA-4、GATA-5及GATA-6，其中GATA-2 是造血干細胞和多能祖細胞的擴展和維持所必需的轉錄因子，控制著干細胞的增殖及分化。在AD 研究中，轉錄因子GATA-2 研究相對較少，鑒于目前沒有可用的外周生物標志物可以檢測AD 發作，有研究者通過對血液基因表達數據的綜合分析，采用微陣列數據鑒定出AD 患者和對照組的差異表達基因（DEG），確定25 個常見的DEG，明確GATA-2 作為AD 的常見轉錄因子之一[19]，具有調節AD 中差異表達基因的功能[7]。另外，對GATA-2的基因敲除研究發現神經球蛋白表達的減少[20]，且在SIRT3 基因的內含子上發現可變數目的串聯重復序列具有增強子活性，并可增加SIRT3 表達[8]。轉錄因子GATA-2 和c-Jun/c-Fos過表達，可增強SIRT3 的VNTR增強子活性[9]，由于c-Jun/c-Fos 二聚體復合物可識別結合在SIRT3 基因串聯重復序列上的激活蛋白1，從而增強SIRT3 的表達及生物學功能。

AD 屬中醫學“呆證”范疇。結合前期研究，本研究從AD 腎虛髓空的病機出發，以益髓醒腦為主要治則，選用“百會”“涌泉”進行治療。研究表明，針灸“百會”“涌泉”可改善線粒體酶活性[21]、提升海馬ATP 表達[22]、減輕線粒體損傷、改善AD 模型的學習記憶能力。臨床研究證實，針刺百會、涌泉可明顯提高AD 患者長谷川癡呆修改量表、簡易精神狀態量表、日常生活能力量表、臨床神經功能缺損量表及中醫辨證量表評分情況[23]，提高AD 治療效果。

本實驗結果表明，針刺可促進SIRT3 調控因子GATA-2 蛋白的表達，改善SAMP8 小鼠的學習記憶能力，提示作為轉錄因子GATA-2 的下游蛋白，SIRT3可在GATA-2 蛋白過表達的作用下，發揮維持線粒體結構穩定、增強線粒體酶活性、減少活性氧產生、改善能量代謝等生物學功能，從而延緩AD 的進展。另外，本實驗RT-PCR 結果與蛋白檢測結果趨勢不一致，但考慮到基因的表達分為轉錄和翻譯2 個層面，即mRNA 和蛋白水平，而真核基因表達的轉錄和翻譯發生的時間和位點存在時空間隔，轉錄后又有轉錄后加工，轉錄產物的降解、翻譯、翻譯后加工及修飾等幾個層面，所以轉錄和翻譯水平并不完全一致。另外，海馬組織線粒體中GATA-2 mRNA與蛋白質豐度的相關性尚未見明確報道，本實驗中GATA-2 mRNA 的表達有待今后繼續研究。

綜上所述，針刺可明顯改善SAMP8 小鼠的學習記憶能力，其機制可能與促進 SIRT3 調控因子GATA-2 蛋白表達的升高，從而改善線粒體的功能、調節能量代謝有關。