基于高通量測序技術研究芍藥湯對潰瘍性結腸炎大鼠腸道菌群的影響

曹暉，吳東升，張彧，鄒博，陳睿旖，李梓菡

湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見的慢性非特異性的腸道炎癥，臨床以腹痛、腹瀉、膿血便等為主要表現，具有病程長、反復發作、難以治愈等特點，被世界衛生組織列為難治病之一[1]。UC病因病機目前尚未完全闡明，腸道菌群失調引起的腸道黏膜免疫異常是UC 的重要原因之一[2]。生理條件下腸道菌群保持動態平衡，當腸道菌群失衡時，有害細菌將過度生長，從而導致結腸疾病的發生。研究發現，益生菌與人類健康密切相關，尤其是腸黏膜屏障[3]。因此，腸道菌群的調控可能是UC 機制研究及治療的一大突破點。

UC 屬中醫學“泄瀉”“腸澼”“久痢”等范疇。其基本病機為濕熱蘊結腸道，氣血相搏，血敗肉腐而成[4]。芍藥湯出自《素問病機氣宜保命集》，具有清臟腑熱、清熱燥濕、調氣和血等功效，是治療UC 的代表方劑之一[5]。本課題組前期研究表明，芍藥湯通過增加腸黏膜中CD4+T 細胞、分泌型免疫球蛋白A（SIgA）的表達減輕腸黏膜免疫屏障的損傷，通過調節白細胞介素（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等因子的表達干預UC 免疫功能[6-7]。鑒于腸道菌群在UC 發病過程和治療中具有重要作用，本研究建立大鼠UC 模型，采用高通量測序技術探究芍藥湯對模型大鼠腸道菌群的影響，從菌群紊亂的角度探討芍藥湯治療UC 的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SD 大鼠50 只，體質量150～170 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002。飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院SPF 級動物房，溫度（22±2）℃，相對濕度40%～60%。實驗前大鼠適應環境3 d，并隨意喂食標準食物和水。

1.2 藥物及制備

芍藥湯（白芍30 g，黃芩15 g，黃連15 g，大黃9 g，當歸15 g，檳榔6 g，木香6 g，肉桂5 g，炙甘草6 g），飲片購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院鄧桂明副主任藥師鑒定均為正品。將飲片混勻后用雙蒸水浸泡2 h，煮沸后小火煎煮30 min，重復1 次，第1 煎加入飲片量8 倍水，第2 煎加入飲片量6 倍水，離心、過濾，取上清液，將2 次煎液合并，使用旋轉蒸發儀減壓濃縮至含原藥材1.1 g/mL，置于4 ℃冰箱保存備用。混合抗生素制備：參考Roddigues 等[8]研究方法制備干預腸道菌群的標準混合抗生素，每次灌胃前將氨芐西林膠囊（珠海聯邦制藥股份有限公司，批號04003103）、硫酸新霉素可溶性粉（長沙巨龍生物科技有限公司，批號20190805）混合溶于蒸餾水中，配制成氨芐西林1 g/L、硫酸新霉素1 g/L 水溶液，甲硝唑氯化鈉注射液（湖南漢森制藥股份有限公司，批號C19102207B）用生理鹽水稀釋為1 g/L，注射用鹽酸萬古霉素（Vianex S.A 公司，批號C880387）配制前先用注射用水溶解，再用生理鹽水稀釋為0.5 g/L。將以上4 種藥物等體積混合后灌胃。美沙拉嗪腸溶片，黑龍江天宏藥業股份有限公司，批號20190109。

1.3 主要試劑與儀器

10%水合氯醛（天津市凱信化學工業有限公司，批號20170328），HE 染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號C0105），5% TNBS（美國Sigma公司，批號SLBX3263），IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號均為201803），糞便基因組DNA 提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司，批號D3141-02），Qubit?雙鏈DNA檢測試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號Q32850），引物序列設計（美國Invitrogen 公司）。TG16W 型微量高速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司），RM2235 型精密輪轉切片機（德國Leica 公司），KD-BM.BL 型組織包埋機（浙江金華科迪儀器設備有限公司），YD-AB 型組織攤烤片機（浙江益迪醫療設備有限公司），BA410E 型光學掃描顯微鏡（日本Olympus 公司），hiseq2500 型高通量測序儀（北京百邁客公司）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

50 只大鼠隨機取10 只作為正常組，剩余40 只大鼠參照前期實驗造模[6]。造模前大鼠禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛（4.0 mL/kg）麻醉，將石蠟油潤滑過的直徑0.4 mm 聚乙烯軟管插入直腸，深度約8 cm，緩慢注入5%TNBS 50 mg/kg＋50%乙醇0.25 mL，再將大鼠提尾倒置60 s，使藥液充分停留結直腸內。正常組給予等體積生理鹽水灌腸，清醒后自由飲水。造模7 d 后隨機抽取2 只模型組大鼠解剖觀察，結腸組織大體觀表現為黏膜多發潰瘍，表面覆有黃濁苔，黏膜充血、水腫；HE 染色顯示結腸黏膜充血、水腫、潰瘍，并有大量淋巴細胞和中性粒細胞浸潤時，提示UC 大鼠模型制備成功[9]。采用隨機數字表法將成模大鼠隨機分為模型組、抗生素組、芍藥湯（11.1 g/kg）組和美沙拉嗪（0.42 g/kg）組。于造模7 d 后開始灌胃給藥，美沙拉嗪組和芍藥湯組2 mL/次，1 次/d；抗生素組2 mL/次，2 次/d；正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，1 次/d，連續給藥7 d。

2.2 標本采集

末次給藥24 h 后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4.0 mL/kg）麻醉，腹主動脈采血，離心，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存待測。采血后脫頸處死大鼠，冷凍取材解剖大鼠并切取結腸，沿腸系膜縱向解剖。收集距肛門約8 cm 處結腸附近的糞便顆粒，放入滅菌EP 管中，-80 ℃冰箱保存，糞便標本送至深圳華大基因科技服務有限公司進行高通量測序技術檢測；另收集距離肛門約8 cm 處結腸組織，進行HE 染色，-20 ℃冰箱保存備用。

2.3 HE 染色

將結腸組織置于4%多聚甲醛中固定24 h 以上。梯度乙醇脫水、二甲苯透明，將組織浸入蠟中包埋，切片（厚度4 μm），脫蠟，蘇木素染色5 min，PBS洗滌，1%鹽酸乙醇中分化，伊紅溶液染色30 s，梯度乙醇脫水，進行透明處理，中性膠密封，鏡下觀察其病理變化。

2.4 ELISA 檢測血清炎癥因子

取大鼠全血，4 ℃、3000 r/min 離心10 min，收集上清液，貯存于-80 ℃冰箱。按ELISA 試劑盒說明書進行操作，測定血清IL-6、IL-1β、TNF-α 的含量。

2.5 高通量測序技術檢測腸道菌群變化

各組隨機選取5 只大鼠糞便標本，使用DNA 試劑盒從大鼠糞便中提取基因組DNA。以帶有341F 5’-806R 的序列為引物，以細菌16S rDNA 的V3～V4區域進行PCR 擴增。2%瓊脂糖凝膠中提取擴增子，并用 AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒純化，以QuantiFluor?-ST 進行檢測定量。純化的PCR 產物通過Illumina 的基因組DNA 文庫制備程序，應用合并的DNA 產物建立Illumina Pair-End 文庫。通過Illumina Mi Seq PE300 平臺進行高通量測序，獲取細菌16S rRNA 基因的V3～V4 可變區堿基序列信息。利用QIIME2.0 軟件包，對測序片段進行OTU Venn圖、主成分分析（PCA），獲取OTU 對應的分類單元（包括門綱目科屬種）及其相應的豐度信息，計算ACE、Chao1、Shannon 等度量指數并用R（v3.1.1）軟件制作相應的稀釋曲線圖，評估樣品中細菌菌群的豐富度和均勻度。通過與數據庫進行比對，對OTU進行物種分類，并分別在門、綱、目、科、屬、種幾個分類等級對各樣品作物種豐度柱狀圖[10]。

3 統計學方法

4 結果

4.1 芍藥湯對模型大鼠腸黏膜病理形態的影響

正常組大鼠腸黏膜完整，腺體排列規則，結構清晰，無水腫、充血或組織壞死；模型組大鼠結腸黏膜結構嚴重受損，腺體排列紊亂或丟失，腸黏膜明顯充血、水腫，大量炎性細胞浸潤，腸壁大量纖維化，病變侵及黏膜下層、肌層甚至漿膜層，伴見明顯潰瘍及炎性肉芽腫；芍藥湯組、美沙拉嗪組、抗生素組大鼠炎性細胞浸潤減少，腸黏膜上皮細胞完整性改善，結腸黏膜損傷減輕，表現為腸黏膜輕度充血、水腫，腺體排列基本完整，少量炎性細胞浸潤，未見明顯凹陷性潰瘍及炎性肉芽腫出現。結果見圖1。

4.2 芍藥湯對模型大鼠血清白細胞介素-6、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α 的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 含量顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，芍藥湯組、美沙拉嗪組、抗生素組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 含量不同程度下降，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05），給藥組間比較差異不明顯。結果見圖2。

圖1 各組大鼠結腸黏膜組織形態（HE 染色，×100）

圖2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（）

4.3 芍藥湯對模型大鼠腸道菌群整體變化的影響

本研究采用OTU Venn 圖分析各組間菌群OTU數量及其種類交叉情況，采用PCA 檢測樣本間菌群豐度整體差異。各組總的/特異性OTU 數分別為正常組681/24、模型組578/34、抗生素組499/45、芍藥湯組683/16、美沙拉嗪組649/14，各組共檢測OUT 867個，其中共有OUT 為325個，占總OTU 數的37.49%；與正常組比較，模型組腸道菌群物種豐度降低；與模型組比較，抗生素組腸道菌群物種豐度降低，芍藥湯組、美沙拉嗪組菌群物種豐度升高。各組樣本OTU豐度的PCA 分析結果顯示，各組間區分明顯，表明TNBS 造模及藥物干預等可影響腸道菌群的豐度及結構；與模型組比較，抗生素組向右分散明顯，表明抗生素組菌群結構較模型組變化較大，芍藥湯組、美沙拉嗪組向左聚集，并有向正常組回歸的趨勢，表明芍藥湯、美沙拉嗪可促進腸道菌群豐度和結構的恢復，且芍藥湯組與美沙拉嗪組的菌群結構具有更高的相似性。結果見圖3、圖4。

4.4 芍藥湯對模型大鼠腸道菌群多樣性的影響

Alpha 多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析[11]，包括ACE、Chao1、Shannon 和Simpson 指數等。前3 個指數越大，后1 個指數越小，表明樣品中的物種越豐富。ACE、Chao1 指數反映單個樣本中物種的群落豐富度，而Shannon、Simpson 指數代表微生物多樣性，通過計算各組樣品的Shannon、Simpson指數制作對應的稀釋曲線。與模型組比較，芍藥湯組、美沙拉嗪組ACE、Chao1、Shannon 指數明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；抗生素組ACE、Chao1、Shannon 指數較模型組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；芍藥湯組與美沙拉嗪比較無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，芍藥湯組、美沙拉嗪組Simpson 指數明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；抗生素組Simpson 指數升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。以上結果表明，與模型組比較，抗生素組腸道菌群多樣性降低，美沙拉嗪組、芍藥湯組腸道菌群多樣性均增加，其中芍藥湯組、美沙拉嗪組菌群多樣性趨近正常組。結果見表1、圖5、圖6。

圖3 各組大鼠腸道菌群OTU 分析

圖4 各組大鼠腸道菌群PCA

表1 各組大鼠腸道菌群Alpha 多樣性比較（）

表1 各組大鼠腸道菌群Alpha 多樣性比較（）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

圖5 各組大鼠腸道菌群Shannon 指數稀釋曲線

圖6 各組大鼠腸道菌群Simpson 指數稀釋曲線

4.5 芍藥湯對模型大鼠腸道菌群物種注釋和差異分析的影響

根據OTU 的絕對豐度和注釋信息，統計分析每個樣本中門和屬水平的序列數與序列總數的比率，以評估每個組在門和屬水平的物種組成差異。門分類水平主要檢測出13 個菌門，其中占比較多的菌門主要是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）。與正常組比較，模型組厚壁菌門和變形菌門豐度減少，擬桿菌門豐度增加；與模型組比較，抗生素組擬桿菌門、厚壁菌門等菌門豐度明顯減少，變形菌門豐度增加，芍藥湯組和美沙拉嗪組較模型組厚壁菌門和變形菌門豐度增加，擬桿菌門豐度減少。屬分類水平物種分析結果表明，與正常組比較，模型組擬桿菌屬（Bacterides）豐度增加，梭菌屬（Clostridium）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、普雷沃菌屬（Prevotella ）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、帕拉普氏菌屬（Paraprevotella）、羅斯氏菌屬（Roseburia）豐度減少少；與模型組及及正常組比較較，抗生素組組菌群變化較大大，菌群種類明顯減少，主要含有乳酸菌屬、擬桿菌屬、薩特氏菌屬（Sutterella）、勞特氏菌屬（Blautia）、埃希氏菌屬（Escherichia）等；芍藥湯組和美沙拉嗪組較模型組擬桿菌屬豐度減少，梭菌屬、顫螺旋菌屬、乳酸菌屬、普雷沃菌屬、瘤胃球菌屬、帕拉普氏菌屬、羅斯氏菌屬豐度增加。見圖7、圖8。

圖7 各組大鼠腸道菌群門分類水平物種柱狀圖

圖8 各組大鼠腸道菌群屬分類水平物種柱狀圖

5 討論

中醫藥治療UC 具有多組分、多靶點的特點，因而療效較好，且具有復發率低、不良反應少等優點。芍藥湯具有調氣活血、清熱利濕功效，為治療濕熱痢疾之主方，《潰瘍性結腸炎中醫診療專家共識》將芍藥湯認定為治療大腸濕熱證UC 的主方[5]。

UC 是一種復發性炎性疾病，其特征在于免疫反應失調和細胞因子釋放失衡。在UC 發病機制中，腸道黏膜免疫系統失衡，主要表現為促炎因子和抗炎因子水平不平衡[12]。因此，對炎性介質的有利調節可為UC 提供可行的治療策略。本實驗中，TNBS 造模引起大鼠結腸病理性損傷，血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平明顯升高，與模型組比較，芍藥湯可有效抑制IL-6、IL-1β、TNF-α 失控釋放，表明其改善UC作用可能與調節炎癥因子密切相關。

腸道菌群組成的變化可能影響腸道微生態，進而影響免疫和代謝功能，并導致多種自身免疫和腸道疾病[13]。腸道菌群在UC 發生發展中起著重要作用。腸道菌群失調的嚴重程度直接影響炎癥的進展速度[14]。本實驗中，Venn 圖、Alpha 多樣性分析等結果顯示，TNBS 造模引起的腸道炎癥使腸道菌群結構發生顯著變化，腸道菌群紊亂是引起腸黏膜炎癥的重要原因，而給藥后菌群結構逐漸恢復，表明芍藥湯可能通過恢復腸道菌群的豐度、多樣性從而減輕腸道炎癥。腸道菌群物種注釋和差異分析結果表明，模型組和芍藥湯組之間腸道菌群的門和屬分類有顯著差異，表明芍藥湯可改善UC 結腸中菌群的多樣性和菌群紊亂，且TNBS 誘導的UC 大鼠中致病菌顯著增加，而保護性細菌（如厚壁菌門、梭菌屬、顫螺旋菌屬等）明顯減少，芍藥湯可增加厚壁菌門、顫螺旋菌屬、乳酸菌屬、普雷沃菌屬、瘤胃球菌屬、帕拉普氏菌屬、羅斯氏菌屬等益生菌或正常菌的相對含量，表明芍藥湯可提高腸道菌群多樣性，促進益生菌和共生菌群的生長，抑制機會性致病菌或有害菌的定植，這有助于維持腸道菌群的穩態。通過對腸道菌群、炎癥因子、腸道炎癥進行相關性分析發現，隨著UC 腸道炎癥的發展，促炎因子分泌增加，損害性細菌增多，保護性細菌減少，腸道炎癥加劇，厚壁菌門、乳酸菌屬、瘤胃球菌屬、羅斯氏菌屬等保護性細菌與IL-6、TNF-α、IL-1β 等促炎因子之間存在顯著負相關，擬桿菌等損害性菌與促炎因子間呈正相關，而芍藥湯可有效逆轉促炎因子及腸道菌群的這種變化趨勢。

綜上所述，腸道菌群與體內細胞因子的分泌和表達密切相關，彼此相互影響，調節免疫功能。芍藥湯對UC 有確切的治療作用，并且可能通過調節腸道菌群的豐度和多樣性影響腸道菌群，進而起到減輕腸道炎癥和治療UC 的作用。