腎衰Ⅱ號(hào)方對(duì)腎功能衰竭大鼠腸通透性及微炎癥的影響

姚東升，徐琳，2，蘭天鷹，葉朝陽(yáng)，2，王琛，2，吳鋒

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腎病研究所，肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203

近年來(lái)，慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，已成為影響人類健康的主要疾病[1]。持續(xù)微炎癥狀態(tài)為CKD 疾病進(jìn)程中的重要組成部分，并與腎功能下降程度密切相關(guān)。近年研究表明，腸道屏障功能下降，通透性增高，導(dǎo)致腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素移位入血是造成CKD 炎癥狀態(tài)的原因之一[2-3]。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腎病科長(zhǎng)期應(yīng)用腎衰Ⅱ號(hào)方治療CKD，臨床療效顯著[4]。本課題組前期基礎(chǔ)研究顯示，該方可通過(guò)改善大鼠腎臟血氧供應(yīng)環(huán)境、減少腎臟細(xì)胞凋亡及自噬、降低炎癥因子、抗氧化應(yīng)激等藥理作用而減輕腎損傷[5-7]。臨床觀察顯示，該方改善CKD 3～4 期患者腎功能、延緩腎衰竭進(jìn)展的作用機(jī)制可能與其減少炎癥因子、調(diào)節(jié)微炎癥狀態(tài)有關(guān)[8]，同時(shí)還觀察到食少納呆、大便不實(shí)等癥狀的改善。提示腸道可能是該方防治CKD、減輕腎毒素的重要藥理靶位。本研究觀察腎衰Ⅱ號(hào)方對(duì)腎功能衰竭大鼠腸通透性及微炎癥的影響，旨在從腸道通透性角度探討腎衰Ⅱ號(hào)方改善5/6 腎切除大鼠微炎癥狀態(tài)的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性SD 大鼠50 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量130～150 g，動(dòng)物許可證號(hào)SCKC（滬）2018-0016，上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物房。

1.2 藥物

腎衰Ⅱ號(hào)方（黨參、丹參、川芎、桃仁、紫蘇葉、淫羊藿、制大黃各15 g），飲片購(gòu)自上海市藥材公司。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥制劑室制備，水提濃縮至含原藥材7.58 g/mL。雙歧三聯(lián)活菌1 g，上海信宜制藥公司，批號(hào)20180521，加蒸餾水制備成50 mg/mL混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）測(cè)定試劑盒（南京建成生物制品研究所），內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒（美國(guó)ACC公司，貨號(hào)21080309C/BU0209），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-6 和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），兔抗大鼠Anti-Occludin antibody（英國(guó) Abcam 公司，貨號(hào)ab216327），Anti-Claudin-1 antibody（英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)ab15098），HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（中國(guó)Beyotime 公司，批號(hào)A0208），HRP 標(biāo)記IgG（H+L）（中國(guó)Beyotime 公司，批號(hào)A0216）。M5 酶標(biāo)儀（賽默飛），Leica DMIL 倒置相差顯微鏡（德國(guó)徠卡）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，備皮后，脊柱向左旁開(kāi)1 cm，左側(cè)肋弓下0.5 cm 處做一垂直于脊柱的切口（長(zhǎng)約2.5 cm）。無(wú)菌條件下經(jīng)腹膜后鈍性游離腎包膜，暴露左腎，分支結(jié)扎左腎動(dòng)脈2/3，關(guān)腹縫合。7 d 后摘除右腎。

2.2 分組與給藥

28 d 后，采用斷尾采血方式測(cè)定腎功能指標(biāo)。剔除造模失敗和死亡大鼠，分別測(cè)量存活大鼠體質(zhì)量，并以其作為變量，隨機(jī)分為模型組、腎衰Ⅱ號(hào)方組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組10 只。另取10 只大鼠為假手術(shù)組。按成人標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量（60 kg）常規(guī)用量20 倍給藥，藥物灌胃劑量參照本課題組既往研究[5]，給藥體積2 mL，每日1 次，連續(xù)60 d。假手術(shù)組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。

2.3 標(biāo)本留取

實(shí)驗(yàn)大鼠禁食5 h 后灌服內(nèi)毒素，每10 min 灌服1 只，劑量10 mg/kg，3.5 h 后取材，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，打開(kāi)腹腔，下腔靜脈取血，取大鼠部分腎臟、10%福爾馬林固定小腸，余腎臟及部分腸道組織-70 ℃低溫保存。

2.4 肌酐、尿素氮檢測(cè)

全血常規(guī)離心后取上清液，測(cè)試盒分析儀檢測(cè)Cr、BUN 含量。

2.5 內(nèi)毒素檢測(cè)

鰲試劑法檢測(cè)下腔靜脈血漿內(nèi)毒素含量，判定腸通透性變化，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.6 炎癥因子檢測(cè)

ELISA 檢測(cè)血清CRP、TNF-α、IL-2、IL-6、MCP-1含量，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.7 病理觀察

常規(guī)固定、石蠟包埋、切片、HE 染色，鏡下觀察腎小球、腎小管、腎間質(zhì)、腎血管、腸道絨毛、隱窩腺體。

2.8 Claudin-1、Occludin 蛋白表達(dá)檢測(cè)

免疫組化檢測(cè)腸道緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin 的表達(dá)。常規(guī)切片，脫蠟乙醇水化，熱修復(fù)后加入一抗4 ℃濕盒孵育過(guò)夜。37 ℃復(fù)溫1 h，加入二抗，顯色，脫水，透明，封片。用PBS 作陰性對(duì)照。鏡下拍照，用Image-Pro Plus6.0 軟件對(duì)照分析，陽(yáng)性表達(dá)以測(cè)得的平均光密度（IOD）表示。

2.9 Claudin-1、Occludin 基因表達(dá)檢測(cè)

RT-PCR 檢測(cè)腸道緊密連接蛋白 Claudin-1、Occludin 的mRNA 表達(dá)。引物序列見(jiàn)表1。提取總RNA 樣本，稀釋成相同濃度，65 ℃孵育5 min，冰浴2 min，以特異性引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。程序：42 ℃、15 min，85 ℃、5 s，以cDNA 為模板擴(kuò)增基因片段，見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，結(jié)果以Ct值表示，用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因PCR 引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 一般情況

假手術(shù)組大鼠一般狀態(tài)良好，反應(yīng)靈活，皮毛光滑，精力充沛；模型組大鼠精神萎靡，皮毛少榮，運(yùn)動(dòng)、覓食較少，體質(zhì)量增加遲緩；腎衰Ⅱ號(hào)方組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠精神較前好轉(zhuǎn)，食欲尚可，無(wú)活動(dòng)受限，體質(zhì)量增加明顯。給藥第6 周腎衰Ⅱ號(hào)方組1 只大鼠因灌胃不當(dāng)意外死亡。

4.2 腎衰Ⅱ號(hào)方對(duì)模型大鼠血清肌酐、尿素氮水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清Cr、BUN 含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，腎衰Ⅱ號(hào)方組血清Cr、BUN 含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，腎衰Ⅱ號(hào)方組血清BUN 含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清Cr、BUN 含量比較（）

表2 各組大鼠血清Cr、BUN 含量比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P＜0.05

4.3 腎衰Ⅱ號(hào)方對(duì)模型大鼠血漿內(nèi)毒素水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿內(nèi)毒素含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，腎衰Ⅱ號(hào)方組大鼠血漿內(nèi)毒素含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血漿內(nèi)毒素含量比較（）

表3 各組大鼠血漿內(nèi)毒素含量比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

4.4 腎衰Ⅱ號(hào)方對(duì)模型大鼠血清炎癥因子水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組血清炎癥因子含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，腎衰Ⅱ號(hào)方組血清炎癥因子含量降低，除MCP-1 外差異均統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

4.5 腎衰Ⅱ號(hào)方對(duì)模型大鼠腎組織病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組大鼠腎臟病理基本正常；模型組腎單位結(jié)構(gòu)雜亂，彌漫性硬化，腎小球可見(jiàn)球囊黏連，周?chē)梢?jiàn)纖維化；腎衰Ⅱ號(hào)方組和陽(yáng)性對(duì)照組腎小球結(jié)構(gòu)較模型組完整清晰，囊腔結(jié)構(gòu)較模型組更完整，未見(jiàn)明顯粘連，腎小球纖維化有所減輕。見(jiàn)圖1。

4.6 腎衰Ⅱ號(hào)方對(duì)模型大鼠腸組織病理形態(tài)的影響

模型組較假手術(shù)組小腸絨毛變短變寬、局部隱窩拉長(zhǎng)；腎衰Ⅱ號(hào)方組、陽(yáng)性對(duì)照組與假手術(shù)組接近。見(jiàn)圖2。

表4 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（）

表4 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)（HE 染色，×400）

圖2 各組大鼠腸組織形態(tài)（HE 染色，×100）

4.7 腎衰Ⅱ號(hào)方對(duì)模型大鼠腸組織 Claudin-1、Occudin 蛋白和基因表達(dá)的影響

免疫組化染色顯示，著色為棕黃至棕褐色，腸黏膜上皮細(xì)胞邊緣廣泛連續(xù)性著色，可見(jiàn)點(diǎn)狀或蜂窩狀聚集，模型組著色散亂不連續(xù)，明顯減少，各給藥組明顯好轉(zhuǎn)，見(jiàn)圖3、圖4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腸組織Claudin-1、Occludin 蛋白和mRNA 表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，腎衰Ⅱ號(hào)方組大鼠腸組織Claudin-1、Occludin 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），mRNA 表達(dá)變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表5、表6。

圖3 各組大鼠腸組織Claudin-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖4 各組大鼠腸組織Occludin 蛋白陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

表5 各組大鼠腸組織Claudin-1、Occludin 蛋白表達(dá)比較（，IOD 值）

表5 各組大鼠腸組織Claudin-1、Occludin 蛋白表達(dá)比較（，IOD 值）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

表6 各組大鼠腸組織Claudin-1、Occludin mRNA 表達(dá)比較（）

表6 各組大鼠腸組織Claudin-1、Occludin mRNA 表達(dá)比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05

5 討論

臨床上微炎癥狀態(tài)常常無(wú)明顯癥狀，是在免疫復(fù)合物、微生物、內(nèi)毒素、補(bǔ)體等刺激下，機(jī)體產(chǎn)生以單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)激活，IL-2、IL-6、TNF-α 促炎因子釋放為主的全身性慢性炎癥狀態(tài)[9]。由腎小球系膜細(xì)胞（MC）分泌產(chǎn)生的IL-6、IL-2、TNF-α 等細(xì)胞因子，可與MC 上相應(yīng)受體結(jié)合，刺激MC 增殖[8]。超量的IL-6、IL-2和TNF-α導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞增殖、腎小球硬化、腎小管間質(zhì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，造成原發(fā)疾病進(jìn)展。IL-2 通過(guò)激活及趨化嗜堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T 細(xì)胞加劇急性炎癥反應(yīng)。

炎癥是CKD 惡化的主要原因之一，但導(dǎo)致CKD炎癥反應(yīng)的起源位點(diǎn)目前尚無(wú)定論。近年研究表明，腸道通透性增加，導(dǎo)致腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素移位入血為造成CKD 炎癥狀態(tài)的原因之一[10-12]。腸道雖然為體內(nèi)消化器官，但卻是一個(gè)體內(nèi)延伸的外部環(huán)境，因?yàn)槟c道內(nèi)包含人體最大的微生物群。腸道除消化食物、排泄廢物外，同時(shí)也可防止微生物及其有害產(chǎn)物進(jìn)入內(nèi)環(huán)境。內(nèi)毒素是寄居在腸道的革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁分解出來(lái)的脂多糖，具有很高的免疫原性。當(dāng)腸道屏障功能下降，腸道毒素尤其內(nèi)毒素入血，使黏附分子、趨化因子和細(xì)胞因子大量產(chǎn)生，造成全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)[13-14]。血清內(nèi)毒素含量可一定程度上反映腸道屏障功能變化。研究表明，益生菌的使用可改善CKD患者的免疫炎癥及氧化應(yīng)激[15]。

腸道屏障功能的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)為腸上皮細(xì)胞間的緊密連接、黏附連接等。其中緊密連接為最重要的連接方式，對(duì)維護(hù)上皮細(xì)胞極性及調(diào)節(jié)腸屏障的通透性發(fā)揮著最主要的作用[16]。緊密連接是由超過(guò)50 種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，通過(guò)吻合點(diǎn)封閉細(xì)胞間隙。Occludin 及Claudins 是參與腸壁通透性的、調(diào)節(jié)緊密連接的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一[17-19]。緊密連接蛋白的減少或破壞將使腸道通透性增高，使大分子物質(zhì)（內(nèi)毒素、病原體等）從腸腔進(jìn)入血液。

中醫(yī)藏象學(xué)說(shuō)認(rèn)為，五臟六腑相互關(guān)聯(lián)、互根互用。大便難解或大便溏泄等“腸”分清泌濁失律，傳導(dǎo)下注失司皆為“腎”病所累。《諸病源候論·大便病諸候》有“邪在腎，亦令大便難。所以爾者，腎臟受邪，虛則不能制小便，則小便利，津液枯燥，腸胃干澀，故大便難，又渴利之家，大便亦難，所以爾者，為津液枯竭，致令腸胃干燥”。腎衰Ⅱ號(hào)方寒熱并用，補(bǔ)瀉兼施，益氣活血，降濁解毒，標(biāo)本兼顧。方中黨參補(bǔ)益脾氣，健脾止瀉；制大黃具有蕩滌腸道之功，通因通用，用于腑實(shí)泄瀉；黃連清熱燥濕，為治療濕熱下注及疫毒所致泄瀉要藥。在治療腎病同時(shí)，腎衰Ⅱ號(hào)方也為治療泄瀉常用藥物，提示腸道很可能是該方防治CKD、減輕腎毒素的重要藥理靶位。

實(shí)驗(yàn)研究表明，5/6 腎切除大鼠模型存在腸道功能障礙、腸道通透性增加[3，20]。本實(shí)驗(yàn)選用5/6 腎切除大鼠模型，參考腸通透性評(píng)價(jià)方式[21]，處死前予內(nèi)毒素灌胃，取材后測(cè)定血漿內(nèi)毒素含量以判斷腸道屏障功能。結(jié)果顯示，模型大鼠炎癥因子及內(nèi)毒素含量顯著升高，表明該模型存在腸道屏障受損、微炎癥狀態(tài)加劇。同時(shí)，緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin 表達(dá)下降，提示緊密連接破壞是該模型腸道機(jī)械屏障功能改變的主要原因。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，養(yǎng)血活血、降濁化瘀為功效的腎衰Ⅱ號(hào)方可改善模型大鼠腎功能，同時(shí)降低血清炎癥因子和內(nèi)毒素的含量，表明改善腸道屏障功能抑制腸源內(nèi)毒素入血降低微炎癥水平是該方有效治療腎功能衰竭的靶點(diǎn)之一。進(jìn)一步檢測(cè)提示，該方可上調(diào)腸組織Claudin-1、Occludin 蛋白表達(dá)，提示緩解腸上皮細(xì)胞緊密連接破壞是該方修復(fù)腸道機(jī)械屏障功能的主要機(jī)制。

綜上，腎衰Ⅱ號(hào)方降低5/6 腎功能衰竭大鼠微炎癥的作用可能是通過(guò)改善腸道通透性而達(dá)到的。這為該方臨證運(yùn)用與新復(fù)方開(kāi)發(fā)佐以科學(xué)依據(jù)的同時(shí)，也為從“腎-腸”角度開(kāi)展中醫(yī)藥防治慢性腎功能衰竭的研究提供可參考的路徑與方法。