外積融合光譜結合HPLC快速測定白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量

王清亞，李福生，江曉宇，張麗嬌，張雄杰，王仁波

1.東華理工大學核技術應用教育部工程研究中心，江西 南昌 330013；2.東華理工大學核資源與環境國家重點實驗室，江西 南昌 330013

白術為菊科植物白術Atractulodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，《神農本草經》將其列為上品，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗等功效[1]。浙江、安徽及江西等地為白術主產地。現代研究表明，白術含有多類化學成分，包括揮發油、內酯、氨基酸等，其中，內酯類成分是白術主要藥效成分，常作為評價白術藥材及飲片質量的參考指標[2]。目前研究多為測定白術中揮發油類[3]、內酯類[4]化合物，如采用HPLC 同時測定白術中白術內酯等多種成分含量[5-7]。該方法雖然測定結果準確，但存在前處理耗時、樣品無法回收、分析結果滯后的缺點，導致無法將其應用于飲片現場檢測。

外積融合分析是將近紅外（NIR）光譜和X 射線熒光（XRF）光譜進行克羅內克積（Kronecker product）運算，得到高維光譜[8]。與單一光譜相比，數據融合后的光譜載有更加豐富的信息，能夠反映不同光譜之間的空間變化，更有利于快速建立定性和定量分析模型[9]，已逐漸廣泛應用于化學計量學的多個領域[10-13]。目前，NIR 光譜和XRF 光譜均已應用于中藥飲片的質量控制[14-16]，但尚缺乏采用外積融合光譜分析對中藥飲片的快速評價研究。因此，本研究選取白術中3種內酯類成分作為外積融合分析的指標，建立白術多成分定量模型，從整體性和專屬性入手，對外積融合分析在白術質量評價方面的應用進行初步探究。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 高效液相色譜儀（含二極管陣列檢測器，美國Agilent 公司），Phenomenex Kinetex@XBC18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），XS-205 型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），KQ-500V 數控超聲波清洗機（江蘇昆山市超聲儀器有限公司），Milli-QAdevantageA10 自動型純水機（美國，Merck Millipore 公司），BJ-150 型高速多功能粉碎機（中國，拜杰公司），ASD FieldSpec3 光譜儀（美國ASD 公司），TEC SONDETS-XH4000 型熒光分析儀（配置Ag 靶、SDD 探測器，浙江泰克松德能源科技有限公司）。

本研究共收集不同產地、不同廠家的123 批白術飲片樣品，均經江西中醫藥大學徐鐵龍副教授鑒定為菊科植物白術Atractulodes macrocephaKoidz.的干燥根莖加工而成的生品飲片，樣品來源信息見表1。白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品均為自制，經HPLC 檢測，歸一法計算，純度均大于99.0%。甲醇、乙腈為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司），液相用水為超純水。

表1 123 批白術飲片樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量測定

色譜條件：流動相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～20 min，55%B；20～40 min，55%～80%B），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，白術內酯Ⅰ、Ⅲ檢測波長220 nm，白術內酯Ⅱ檢測波長276 nm，進樣量10 μL。

分別精密稱取白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品于10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，定容至10 mL，制成濃度分別為1.724、1.995、2.289 g/L 的單一對照品貯備液。精密吸取各單一對照品貯備液2 mL，定容至25 mL，得白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ濃度分別為0.137 9、0.159 6、0.183 1 g/L 的混合對照品貯備液。

供試品溶液制備參照2015 年版《中華人民共和國藥典》方法。樣品粉碎后過篩，取細粉2 份，各1.0 g，精密稱定，分別置于50 mL 錐形瓶中，精密量取2 份甲醇各50 mL，分別加入錐形瓶中，充分搖勻。一份超聲60 min，另一份水浴回流60 min，冷卻后加甲醇補足溶劑揮發的量，置于錐形瓶中備用。

HPLC 圖見圖1。3 種白術內酯與對照品保留時間一致，各成分均達到基線分離，具有較好的對稱性。

圖1 白術中3 種白術內酯HPLC 圖

2.2 光譜采集

2.2.1 近紅外光譜

將制備好的樣品分別裝入直徑12 cm、深3 cm 盛樣皿中，表面刮平，選擇50 W 鹵素燈為光源，光源距離樣品表面50 cm，天頂角15°，光纖探頭到樣品距離為10 cm，每10 次測量使用白板標定[17]，每個樣品于8 個方向采集24 條光譜曲線，取信噪比最佳的10 次算術平均值作為該樣品的NIR 原始光譜。

2.2.2 X 射線熒光光譜

取研磨后的樣品，裝進樣品杯，壓實，覆蓋麥拉膜。選用中藥模式，測試時間為90 s。每測30 個樣品進行1 次校正。同一樣品測試3 次，取平均值作為該樣品的XRF 光譜。

2.3 光譜特征分析

將測試得到的反射光譜轉換成信息量更大的吸收光譜，樣品光譜見圖2。123 批樣品的NIR 光譜曲線形態大致相同，曲線近似平行，可見光波段吸收率小于近紅外波段，差別略小。特征吸收帶集中在短波紅外波段（1000～3000 nm）位置1190、1400、1720、2140、2300、2460 nm。在這個波段，樣品的吸收主要由-OH、CO-OH、NH4+、Al-OH、Fe-OH、CO32-等分子團化學鍵的伸展、彎曲、變動等振動引起[18]。3 種白術內酯中均含有C-H 和O-H 基團[19-20]，會在光譜中引起不同的吸收特征。較弱的1190 nm 對應C-H鍵二級倍頻伸展的吸收，1400 nm 處的吸收來自水分子和羥基（-OH）二級倍頻；1720 nm 處的吸收是C-H鍵的二級倍頻，2140 nm 處為C-H 和C-O 組合吸收峰；2300、2460 nm 附近峰值分別來自C-H 鍵和O-H 鍵的合頻。從圖2B 可見，各樣品中共有元素種類基本相同，包括鎂（Mg）、磷（P）、硫（S）、鈣（Ca）、鐵（Fe）、鎢（W）、鋅（Zn）、鍶（Sr）等元素。

圖2 白術樣品光譜圖

2.4 校正集與驗證集劃分

選用K-S（Kennard-Stone）算法計算樣品中白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量的歐式距離，設置95%置信區間，剔除超出置信區間的樣本，剩余108 份。選用60%樣品用于建模，40%樣品用于預測和驗證，結果見表2。

表2 白術內酯定量模型中校正集與驗證集信息

2.5 光譜預處理及融合

2.5.1 光譜預處理方法選擇

將NIR 光譜和XRF 光譜數據引入定量分析模型，需采用特定的化學計量學方法對原始光譜進行預處理，可有效降低原始光譜的噪聲、基線漂移和光的散射等[21]。本研究以偏最小二乘法（PLS）結合決定系數（R2）、校正均方根誤差（RMSEC）、預測均方根誤差（RMSEP）為指標，比較不同預處理方法對模型的影響，包括標準正態變換（SNV）、多元散射校正（MSC）、Savitzky-Golay 平滑（S-G）、一階導數法（1stD）、二階導數法（2ndD）等。R2反映模型建立的穩定性，RMSEC和RMSEP用來驗證模型預報能力[22]。不同處理方法對白術內酯定量分析模型的影響見表3、表4。NIR 光譜定量模型普遍比XRF 光譜定量模型預測性能好，表明NIR 光譜對微量有機物更敏感，適用于有機物含量的檢測，與前人研究結果[23-25]相符。

白術內酯Ⅰ、Ⅱ模型選取MSC＋1stD＋S-G 組合方案，白術內酯Ⅲ模型選取SNV＋1stD＋S-G 組合方案。對比XRF 光譜不同預處理方法，白術內酯Ⅰ模型選取MSC＋2ndD＋S-G 組合方案，白術內酯Ⅱ模型選取MSC＋1stD＋S-G 組合方案，白術內酯Ⅲ模型選取SNV＋2ndD＋S-G 組合方案。

表3 NIR 光譜不同預處理方法對3 種白術內酯定量模型的影響

表4 XRF 光譜不同預處理方法對3 種白術內酯定量模型的影響

在光譜預處理中，將光譜截取出數據較為豐富的一段。NIR 選取450～2450 nm 段（2000 個通道），轉換成吸收光譜。XRF 光譜選取0.405～42.105 keV 段（2000 個通道），可消除低能射線影響。分別按已選取的組合方案進行處理。由于外積融合會形成大量數據，故需要對預處理后的光譜進行重采樣200 個通道，分辨率分別為10 nm、0.2 keV。處理后的NIR 光譜數據范圍為-0.95～2.36，XRF 光譜數據范圍為-1.48～2.82，解決了不同物理量融合時量綱不一致的問題。

2.5.2 外積融合光譜構建

外積融合實質上是求取NIR 光譜和XRF 光譜的克羅內克積[26]。克羅內克積定義為：設A＝（aij）m×n，B＝（bij）p×q，則A 與B 的克羅內克積A ?B=。具體流程為：先測試樣品，得到一組具有r個變量的XRF 光譜和c個變量的NIR 光譜：；再求取該樣品的XRF 光譜和NIR 光譜的克羅內克積：，式中，An即第n個樣品XRF 光譜和NIR 光譜的外積融合光譜，是一個200×200 的矩陣。融合過程見圖3。

2.6 定量分析模型及評價

在光譜分析中構建多維矩陣通常是將其展開成一行，再利用主成分分析或偏最小二乘回歸算法對光譜進行聚類或回歸分析[27]，但會丟失許多二維矩陣的數據結構信息。而基于三線分解和經典偏最小二乘的三維矩陣校正算法多維偏最小二乘（N-way partial least square，N-PLS）數學模型[28]，用于激發-發射熒光光譜、色譜-質譜聯用等多維光譜的化學計量學研究效果較好。對于多維光譜矩陣X（I×J×K）和濃度矩陣Y（I×L），N-PLS 回歸模型可表示為：。式中，T、U表示得分矩陣，W和Q表示載荷矩陣，B為回歸系數矩陣，EX、EY和EU表示殘差矩陣。白術內酯定量模型中，X 為108 個樣品的外積融合矩陣X（108×200×200），Y 為白術內酯的含量矩陣Y（108×1）。采用交叉驗證均方根誤差（RMSECV）分析N-PLS 模型的最佳主成分數（見圖4），白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的最小RMSECV分別對應主成分5、6、6。

圖3 XRF 光譜與NIR 光譜外積融合過程

圖4 白術內酯N-PLS 模型主成分數對RMSECV 的影響

N-PLS 模型對校正集和預測集樣品中白術內酯預測含量與檢測含量的線性擬合見圖5。白術內酯Ⅰ：校正集中預測含量（Cpc）與參考含量（Crc）的線性關系為Cpc＝1.006 74Crc－0.003 94，R2＝0.946 4，RMSEC＝0.021 8；預測集中預測含量（Cpp）與實際含量（Crp）的線性關系為Cpp＝1.019Crp－0.005，R2＝0.918 0，RMSEP＝0.031 1。白術內酯Ⅱ：校正集中，Cpc與Crc的線性關系為Cpc＝0.994Crc，R2＝0.917 2，RMSEC＝0.018 1；預測集中，Cpp與Crp的線性關系為Cpp＝0.993Crp＋0.002，R2＝0.905 1，RMSEP＝0.025 8。白術內酯Ⅲ：校正集中，Cpc與Crc的線性關系為Cpc＝1.027Crc－0.013，R2＝0.955 8，RMSEC＝0.040 0；預測集中，Cpp與Crp的線性關系為Cpp＝1.09Crp－0.045，R2＝0.946 5，RMSEP＝0.049 8。

圖5 白術內酯預測值與檢測值的相關性

2.7 模型驗證

對白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ模型的預測值與檢測值進行配對t檢驗，P值分別為0.799 1、0.830 2、0.940 6，表明外積融合光譜的預測值與檢測值差異無統計學意義（P＞0.05），外積融合光譜與HPLC 之間的系統誤差較小。

3 討論

2020 年版《中華人民共和國藥典》將XRF 光譜和NIR 光譜技術列為通用檢測技術，必將促進這2項快速、無損檢測技術的研究，以及中藥品質規范化要求的提高。本研究通過外積融合光譜的形式，將NIR 光譜和XRF 光譜進行融合，采用N-PLS 建立白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的定量模型，得到RMSEC分別為0.021 8、0.018 1、0.040 0，RMSEP分別為0.031 1、0.025 8、0.049 8。與單純使用XRF 光譜和NIR 光譜的模型結果比較，外積融合光譜定量模型預測精度更高（R2分別為0.946 4、0.917 2、0.955 8）。試驗結果表明，外積融合光譜保留了2 種光譜與目標成分之間的相關性，增強了光譜數據的線性，與相關研究結果[29]相符。同時，外積融合光譜與HPLC 所建立的模型之間系統誤差較小。此方法集合了XRF 光譜和NIR光譜的優點，較HPLC 更加快捷、高效，能夠滿足中藥飲片工業化生產過程中大規?；瘜W信息批量采集需求。