以MOFs為載體的漆酶固定化研究進展

程 耕，成 念，王營茹

(武漢工程大學化學與環境工程學院，湖北 武漢 430205)

漆酶(laccase，EC 1.10.3.2)是一類含銅的糖蛋白氧化酶，也稱為多酚氧化酶，屬于多銅氧化酶家族。漆酶具有較強的氧化能力，能夠以溶液中的分子氧作為電子受體催化分解多種酚類化合物，如單寧酸[1]，因此，可廣泛應用于水體中有機污染物的降解以及環境中酚類物質的檢測[2]。然而，游離漆酶由于難以回收、環境穩定性差、重復利用率低等而限制了其在工業污水處理中的應用，近年來，有學者提出通過固定化解決上述問題。

固定化是通過物理化學方法將天然酶固定在載體上，使游離態的天然酶成為一種非均相的催化劑存在于反應體系中，同時提高酶的環境穩定性與重復利用率。酶固定化的核心要求是：酶與載體結合穩定不脫落；酶活不降低；不影響底物與酶分子活性位點的接觸。但是劇烈的固定化方法以及交聯劑的使用可能影響酶的結構及性質，導致酶活降低；而溫和的固定化方法則無法保證結合的牢固性。

隨著材料科學的迅速發展，具有不同尺寸和性質的材料為酶固定化技術突破傳統束縛提供了可能。金屬有機框架(MOFs)材料是一種由金屬簇或無機金屬離子與有機配體橋連而成的多孔材料，也被稱作多孔配位聚合物(PCP)[3]。MOFs材料具有許多優異的性能以及特殊的結構特點，如超大的比表面積、分布均勻的孔道、可調節的孔徑等[4]，越來越多的研究者將其作為生物催化劑的固定化載體。MOFs材料最顯著的特點是其納米孔隙的可調控性，可以通過選用不同的中心離子與有機配體制備不同孔徑的材料。根據目標物質的種類、大小、性質制備相應孔徑的MOFs材料用于氣體儲存與分離、藥物輸送、催化劑負載、酶固定化等方面是目前MOFs材料研究的熱點[5]。因此，作者根據漆酶固定化的3種方式：吸附法、共價結合法、包埋法，對比MOFs材料與傳統載體材料用于漆酶固定化的效果，著重介紹MOFs材料作為固定化載體的獨特優勢，為漆酶固定化研究提供參考。

1 漆酶的結構與催化機理

1.1 漆酶的結構

漆酶是19世紀末首次從漆樹Rhusvernicifera的汁液中分離得到。在自然界中發現的漆酶大多為植物漆酶和微生物漆酶以及少量的動物漆酶，工業用漆酶按照其來源可分為兩大類——漆樹漆酶、真菌漆酶[6]。目前廣泛研究的漆酶多屬于真菌漆酶，主要分布在引起白腐病的多孔菌、子囊菌、一些食用菌類以及木腐菌云芝等體內。

漆酶是一類含銅的酚氧化酶，半胱氨酸-組氨酸二肽組成了電子傳遞的橋梁，其活性中心含有的4個銅離子按照其光譜和電子順磁共振(EPR)特性可分為3類：1個Ⅰ型銅離子(T1Cu)、1個Ⅱ型銅離子(T2Cu)、2個Ⅲ型銅離子(T3Cu)[7-8]。其中，T1Cu相對獨立，為單核銅離子位點；T2Cu與2個T3Cu組成1個三核銅離子簇(TNC)協同發生作用。T1Cu在大約600 nm處有特征吸收峰，使漆酶表現為藍色，因此也稱為“藍銅”[9]，T1Cu位點通過半胱氨酸(Cys)的巰氫基團以及組氨酸(His)的咪唑環分別與其相連，形成三角結構，由于Cu-S(Cys)鍵高度共價的性質，T1Cu具有順磁性，能夠通過EPR波譜儀測定。T2Cu沒有明顯的特征吸收峰，其EPR譜具有與經典四方銅配合物類似的平行超精細耦合常數(AⅡ=1.4×10-2～2.0×10-2cm-1)，能夠通過EPR波譜儀測定。T3Cu為雙核銅離子位點，靜息氧化狀態下的銅離子之間通過羥配位體進行橋連呈現反磁性，因此無法通過EPR波譜儀檢測，該羥配位體在330 nm處有強吸收，能夠通過UV-Vis法測定[10-11]。T2Cu與T3Cu組成的TNC有8個銅離子(6個T2Cu，2個T3Cu)通過His咪唑環配位。圖1為枯草芽孢桿菌漆酶活性中心結構[12]。

圖1 枯草芽孢桿菌漆酶活性中心結構

漆酶屬于多銅氧化酶家族，通常來說漆酶的活性中心包含4個銅離子，但研究發現有些漆酶的活性中心只包含1個或2個銅離子。如由Phlebiaradiata產生的漆酶活性中心包含2個銅離子和1個充當Ⅲ型銅離子作用的吡咯喹啉醌[9]；真菌Phellinusribis產生的漆酶由2個質量為 76 kDa的亞基組成，其中包含1個銅離子、1個錳離子以及2個鋅離子[13]。

1.2 漆酶的催化機理

漆酶屬于酚氧化酶類，能夠有效地完成氯酚、四環素、三氯生等酚類污染物的去除以及轉化[14-16]。漆酶活性中心的4個銅離子分為2個底物接觸位點：T1Cu位點和TNC位點，分別控制著催化過程的2個階段：T1Cu位點控制底物的氧化以及中間自由基的產生階段；TNC位點控制分子氧的還原階段。在催化過程中，T1Cu從還原態底物吸收1個電子進行單電子氧化過程，還原態底物被氧化成自由基或活性中間體，例如漆酶與酚類物質結合能夠產生苯氧自由基；隨后中間體通過C-C、C-O-C、C-N等鍵共價結合成二聚體[17]；二聚體再作為底物被氧化產生自由基，以類似的途徑形成三聚體直至生成高聚體等聚合物沉淀，達到去除污染物的目的[18]。T1Cu從底物獲取電子后，通過Cys-His通道傳遞至TNC位點，完成以分子氧作為電子受體的四電子還原過程，最終產物為水。

Shleev等[19]對漆酶的催化機理提出如下假設(圖2)：TNC從T1Cu位點接受電子后，以分子氧作為受體被還原，由“天然態中間體”(C)形成“完全還原態”(A)的漆酶，隨后與分子氧繼續作用，在T2Cu與T3Cu之間形成-O-O-鍵成為“過氧化物中間體”(B)。另一種假設是:“天然態中間體”(C)通過其氧橋的斷裂而慢慢衰變，形成“靜止氧化態”(D)，但是形成“完全還原態”的速率太慢，不足以產生催化效果。

圖2 漆酶催化過程中銅離子氧化還原機理示意圖

2 MOFs材料固定漆酶的方法及優勢

漆酶是一種水溶性蛋白質，游離狀態下穩定性差，在極端溫度、極端pH值條件下會影響其三維結構以及活性基團的解離，導致活性降低甚至喪失。固定化可有效提高游離漆酶的環境穩定性、可回收性、重復利用率等，是一種效果明顯、可操作性強、成本低的提高酶穩定性的方法。酶固定化技術的主要環節是負載方法以及載體的性能，而負載方法的選擇往往取決于載體的性能，性能優良的載體須滿足以下3個要求：1)載體表面存在能與酶發生偶聯的活性基團，保證酶與載體之間穩定結合；2)載體具有一定的機械強度與生物相容性，載體自身不會影響酶的活性；3)載體具有可觀的比表面積與孔隙率，不會影響底物與活性位點的結合。目前，一些傳統的大比表面積多孔材料如石墨烯、介孔二氧化硅、多孔磁性材料以及凝膠類材料作為酶固定化載體受到廣泛關注。這些傳統材料雖然在一定程度上能夠實現酶的固定化，但均具有一定的局限性[20-21]，如石墨烯材料制備成本相對較高、介孔二氧化硅材料存在酶的浸出、多孔磁性材料需要借助交聯劑從而影響酶的活性等。

MOFs材料由金屬離子與有機配體“自組裝”而成，具有良好的吸附性能、可調節的孔徑以及表面官能團靈活易修飾等特點，是理想的酶固定化載體[22]。與傳統載體相類似，漆酶與MOFs材料的固定化方式有以下3種：吸附法、共價結合法、包埋法。同時，MOFs材料相比于傳統載體有獨特的優勢，下面按照固定化方式介紹MOFs材料作為漆酶固定化載體的優勢。

2.1 吸附法

吸附法是利用載體與酶之間的靜電吸附作用、疏水作用、范德華力等物理作用使酶固定在載體上[23]。吸附法屬于比較溫和的固定化方法，通常是將載體與酶液混合攪拌使其吸附，固定過程不會造成酶活的損失，但是酶與載體之間作用力較弱，在使用過程中酶容易脫落流失。常見的吸附載體有無機載體：介孔二氧化硅、活性炭、硅膠等[24-25]；天然高分子載體：淀粉、蛋白質等；大孔合成材料載體：合成樹脂、陶瓷材料等[26]。

海泡石是一種纖維狀的硅酸鎂粘土材料，具有良好的吸附性能，常用于催化劑的負載研究。Olshansky等[27]利用海泡石作為漆酶固定化載體，其對漆酶的吸附率達到了(52±2)%，并且通過測量吸附前后溶液中漆酶活性以及活性檢測后漆酶的脫落情況發現，固定在海泡石中的漆酶活性提高了200%～250%。海泡石優秀的吸附性能源于其超大的比表面積以及多孔結構，其比表面積最高可達900 m2·g-1。

MOFs材料擁有均一分散的孔徑，其孔隙率非常高，孔徑大小、體積可以通過不同的有機配體-中心離子組合進行調控，因而具有更大的比表面積。法國Ferey課題組[28]合成了經典的MIL(material institute lavoisier)系列MOFs材料，其中MIL-101的比表面積高達5 900 m2·g-1。Zhong等[29]使用表面活性劑模板法合成了介孔Cu-MOF材料，用于漆酶固定化，通過調整模板劑CTAB與洗脫劑EDTA的比例控制所合成的Cu-MOF的孔徑大小，Cu-MOF的比表面積達1 153.8 m2·g-1，其對漆酶的吸附率高達88%，同時固定化漆酶的活性回收率達95.9%。

2.2 共價結合法

MOFs材料由金屬離子與有機配體之間的超分子力“自組裝”而成，有機配體的多樣性使得MOFs材料很容易實現功能化，通過材料表面基團與漆酶進行共價偶聯，使得漆酶固定于MOFs材料表面。漆酶與MOFs材料的共價結合相對于吸附而言更加穩定。Olshansky等[27]使用殼聚糖對海泡石進行改性，以提高漆酶的固定化效果，殼聚糖改性海泡石對漆酶的吸附率高達70%，而未改性海泡石對漆酶的吸附率僅52%。

共價結合法不僅負載量優于吸附法，并且能夠使漆酶的三維結構變硬，提高漆酶的環境穩定性。Skoronski等[30]將石墨烯進行硝化，隨后通過硼氫化鈉還原以及戊二醛交聯，使漆酶以共價結合的方式固定在石墨烯上，發現共價結合法固定化漆酶在負載量增多的同時，能夠重復使用8輪仍保持80%以上的活性，而吸附法固定化漆酶在重復使用2輪后便迅速失活；而且共價結合法固定化漆酶能夠耐受更廣泛的溫度環境，在30 ℃便能達到最佳活性，遠低于吸附法固定化漆酶所需要的50 ℃，這一點在工程運用中至關重要。

Patra等[31]利用固定化漆酶作為生物燃料電池的陰極，通過漆酶與ABTS的酶-介體系來提高生物燃料電池的電子傳遞效率，所用載體為MIL-100(Fe)材料，其比表面積高達1 350 m2·g-1，但是由于其孔徑僅3 nm左右，而漆酶分子大小約為6 nm，無法進入MIL-100(Fe)材料孔道，因此使用牛血清蛋白保護漆酶結構同時利用戊二醛作為交聯劑提高漆酶的固定化效果。結果表明，由于MIL-100(Fe)材料良好的電導率以及電荷轉移動力學方面的出色表現，該生物電極表現出非常好的氧化還原電催化電流密度與可再現的電化學響應，在長達3周的使用中表現出極佳的穩定性。

2.3 包埋法

上述兩種方法均是將漆酶分子固定在MOFs材料表面，從而提高漆酶的穩定性及環境耐受性，但是MOFs材料本身很難對漆酶分子提供保護，反應體系中的各種離子或者有機溶劑依舊會破壞漆酶結構，導致活性損失。包埋法可將漆酶分子截留、限制在MOFs材料內部，能夠最大限度地保護漆酶不受環境影響，提高漆酶的重復利用率。包埋法根據作用時載體的狀態可分為孔道包埋法和仿生礦化法。

孔道包埋法是將漆酶分子限制在MOFs材料的孔道中，并通過范德華力、π-π相互作用使漆酶分子被固定。雖然孔道包埋法能夠保護漆酶的活性位點，明顯提高漆酶的重復利用率和環境耐受性，但常見的MOFs材料孔徑通常在2～3 nm，小于許多生物大分子直徑，如漆酶分子直徑達到了6 nm左右。因此，不僅需要設計孔徑合適的MOFs材料，同時需要考慮漆酶分子的大小。目前，鮮有MOFs材料通過孔道包埋法固定化漆酶的研究。

仿生礦化法是指在載體合成過程進行固定化，也稱共沉淀法、原位合成法。由于MOFs材料的孔徑較小，為了將漆酶分子限制在其中，在MOFs材料合成過程中加入漆酶，以合成新型的MOFs-漆酶復合物。由于漆酶是在MOFs材料的制備過程中加入，因此MOFs材料的制備條件應比較溫和，以保持漆酶的活性。傳統的MOFs材料也能夠通過仿生礦化法固定漆酶，常見的有海藻酸鹽[32]。海藻酸鹽是一種可以絡合二價離子的天然高分子有機物，通常以海藻酸鈉形式儲存，能夠在一定濃度的二價離子溶液中形成定型的固體海藻酸鹽。Ratanapongleka等[33]在海藻酸鈉與氯化鋇溶液制備海藻酸鋇的過程中加入漆酶酶液以制備固定化漆酶用以去除污染物乙酰氨基酚，固定化漆酶在pH值及溫度耐受性方面有明顯的提高，并且重復使用5輪后能夠保持70%以上的活性。仿生礦化載體雖然對漆酶分子的保護十分到位，但是也會掩蓋漆酶分子的活性位點，影響底物與活性位點的接觸。研究表明，在酶加量及反應條件相同的情況下，固定化漆酶對污染物的降解率只有游離漆酶的20%左右。

MOFs材料有著可觀的孔隙率，在固定漆酶后依舊能夠保證漆酶活性位點與底物的結合。Zhang等[34]使用銅離子作為金屬中心制備MOFs材料Cu-HKUST-1，并且先使用漆酶與氯化銅溶液進行混合接觸，使漆酶上的酰胺基與Cu2+配位，形成Cu-HKUST-1的中心，隨后制備固定化漆酶。對比游離漆酶與該固定化漆酶對雙酚A的去除效果發現，固定化漆酶在大幅提高pH值和溫度耐受性的同時，能夠達到相同量游離漆酶60%左右的去除率，并且在高溫、極端pH值條件下固定化漆酶具有更高的相對活性，重復使用10輪后依舊保持80%以上的活性。

3 結語

MOFs材料是一類前景廣闊的漆酶固定化載體材料，在有效保護漆酶分子的同時發揮漆酶獨特的四電子還原過程；具有極佳的電導率，在一定程度上可提高漆酶的電子傳導效率，提高漆酶活性。但不論是MOFs材料本身的研究亦或是用于漆酶固定化的研究都處于初級階段，還存在許多問題。MOFs材料本身屬于納米級別，用以固定漆酶之后在反應體系中依舊難以回收，需要對材料加以磁性或是再次固定在較大的載體上以便于回收。再者，MOFs材料的孔徑對于生物大分子來說相對較小，不便完全利用其巨大的比表面積優勢，使用仿生礦化法又對材料的制備方式有很高的要求。總之，MOFs材料固定化漆酶是跨領域材料研究的熱門課題，也是正處于發展上升期的研究新課題，需要更多的創新性方案。