蘆葦秸稈混合發酵制備乙醇的工藝優化

蔡世欣，李 敏，侯余勇，王巍杰*，陳方見*

(1.華北理工大學生命科學學院，河北 唐山 063210；2.中國科學院天津工業生物技術研究所 天津市工業生物系統與過程工程重點實驗室，天津 300308)

隨著工業的迅速發展，世界石油消耗量急劇增長，能源短缺問題日益突出，生物質能源作為可再生能源逐漸成為世界各國研究的熱點[1]。然而，原料成本高成為制約生物質能源發展的主要瓶頸，低成本的植物纖維因可作為發酵底物而受到廣泛關注[2]。纖維素作為一種大分子多糖是目前分布最廣的生物質，為生物質能源的生產提供了大量原材料[3]。我國秸稈類生物質大多被直接燃燒，不但造成資源浪費，還污染環境。利用秸稈發酵生產燃料乙醇既能保護環境，也可充分利用資源，創造經濟價值[4]。鑒于此，作者以蘆葦秸稈為原料，用堿液對其進行預處理以促進秸稈纖維素糖化，再通過釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和產朊假絲酵母(Candidautilis)混合發酵制備乙醇，在單因素實驗的基礎上，采用Plackett-Burman(PB)實驗、最陡爬坡實驗和響應面實驗對制備工藝進行優化。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

蘆葦秸稈，采自華北理工大學曹妃甸校區周邊。

纖維素酶，和氏璧生物技術有限公司；酵母膏、胰蛋白胨，英國Oxoid公司；所用試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

SLQ6A型粗纖維測定儀；THZ-92A型氣浴恒溫振蕩器；T6型紫外可見分光光度計；HHS-21-6型數顯恒溫水浴鍋。

1.2 菌種與培養基

釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司；產朊假絲酵母，鶴壁百惠生物科技有限公司。

基礎培養基：1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(9.2 mL 0.1 mol·L-1檸檬酸溶液+10.8 mL 0.1 mol·L-1檸檬酸鈉溶液，pH值4.8)。

發酵培養基：2.0%蛋白胨、0.1%磷酸二氫鉀、1.0%磷酸氫二鉀、0.1%硫酸鎂、0.1%氯化鈉的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。

1.3 預處理方式的選擇

分別稱取5.0 g粉碎過20目、40目、60目和80目篩的蘆葦秸稈置于錐形瓶中，按料液比1∶10(g∶mL,下同)加入50 mL堿液(NaOH或NaOH∶尿素=3.85∶1)，置于80 ℃水浴鍋中預處理2 h；將預處理過的蘆葦秸稈多次沖洗，烘干；采用粗纖維測定儀測定蘆葦秸稈中纖維素含量，以確定最優的預處理方式。

1.4 發酵方式的選擇

發酵菌種的選擇：稱取預處理后的蘆葦秸稈5.0 g，按料液比1∶30加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液和10%纖維素酶。將在基礎培養基中生長至對數期的釀酒酵母、產朊假絲酵母或混合酵母(1∶1，釀酒酵母和產朊假絲酵母的配比)按10%接種量分別接種至發酵培養基中；于30 ℃、150 r·min-1發酵70 h；然后采用DNS法[5]測定發酵液中還原糖含量，采用重鉻酸鉀比色法[6]測定發酵液中乙醇含量，以確定最優發酵菌種。

混合酵母配比的選擇：將不同配比(1∶1、2∶3、3∶2、4∶1、1∶4)的混合酵母按上述方法分別接種至發酵培養基中，測定發酵液中乙醇含量，以確定混合酵母的最優配比。

1.5 蘆葦秸稈混合發酵制備乙醇的工藝優化

1.5.1 單因素實驗

分別考察混合酵母接種量(6%、7%、8%、9%、10%、11%)、纖維素酶用量(6%、8%、10%、12%、14%)、料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40)、轉速(120 r·min-1、130 r·min-1、140 r·min-1、150 r·min-1、160 r·min-1)、發酵時間(24 h、48 h、60 h、72 h、84 h)、發酵溫度(28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃)對乙醇含量的影響。

1.5.2 響應面實驗

做好鄉鎮基層農業統計工作任重而道遠，只有結合鄉鎮基層農業統計工作實際，在提高認識、加強制度建設和管理，以及提高人員隊伍素質等多方面入手，不斷努力改進，才能切實形成整體合力，推動基層農業統計工作扎實開展、有力開展。

在單因素實驗的基礎上，選取混合酵母接種量、纖維素酶用量、料液比、轉速、發酵時間、發酵溫度等6個因素的高、低水平(表1)，利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件設計Plackett-Burman(PB) 實驗，篩選出影響最大的3個因素進行最陡爬坡實驗；以最陡爬坡實驗確定的中心點、采用Box-Behnken(BB)設計響應面實驗，優化蘆葦秸稈混合發酵制備乙醇的工藝條件。

表1 PB實驗的因素與水平

2 結果與討論

2.1 葡萄糖和乙醇的標準曲線(圖1)

圖1 葡萄糖(a)和乙醇(b)的標準曲線

對圖1曲線進行擬合，得葡萄糖和乙醇的線性回歸方程分別為：y=1.017x-0.0294(R2=0.9948)，y=20.047x-0.1046(R2=0.9988)。表明，葡萄糖含量在0～1.2 g·L-1范圍內、乙醇含量在0～7 g·L-1范圍內與吸光度線性關系良好。

2.2 預處理方式對纖維素含量的影響(圖2)

從圖2可以看出，對于不同目數的蘆葦秸稈，采用添加尿素的混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預處理后的纖維素含量均明顯高于采用單一堿液(NaOH)的；其中60目蘆葦秸稈用混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預處理后，纖維素含量達到60.7%。因此，確定采用混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)對60目蘆葦秸稈進行預處理。

圖2 預處理方式對纖維素含量的影響

2.3 單一酵母發酵和混合酵母發酵效果對比(圖3)

圖3 單一酵母發酵和混合酵母發酵效果對比

從圖3可以看出，混合酵母(1∶1)發酵時的乙醇含量明顯高于單一酵母發酵，比釀酒酵母和產朊假絲酵母發酵時的乙醇含量分別提高了28.76%和42.78%。表明，蘆葦秸稈混合酵母發酵可以有效提高乙醇含量。因此，確定采用蘆葦秸稈混合酵母發酵制備乙醇。

2.4 混合酵母配比對乙醇含量的影響

當釀酒酵母與產朊假絲酵母配比分別為1∶1、2∶3、3∶2、4∶1、1∶4時，發酵液中乙醇含量分別為7.24 g·L-1、8.17 g·L-1、9.05 g·L-1、8.92 g·L-1、6.17 g·L-1。其中，在釀酒酵母與產朊假絲酵母配比為3∶2時，乙醇含量最高。因此，確定混合酵母最優配比為3∶2。

2.5 最優制備工藝

2.5.1 單因素實驗結果(圖4)

從圖4a可以看出，隨著混合酵母接種量的增加，乙醇含量先快速升高后趨于穩定；在混合酵母接種量為10%時，乙醇含量達到最高。因此，混合酵母接種量以10%較為適宜。

圖4 單因素實驗結果

從圖4b可以看出，隨著纖維素酶用量的增加，乙醇含量快速升高；當纖維素酶用量超過10%后，乙醇含量升速趨緩。綜合考慮成本等因素，纖維素酶用量以12%較為適宜。

從圖4c可以看出，隨著料液比的減小，即檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液用量的增加，乙醇含量呈先升高后降低的趨勢?？赡苁且驗?，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液用量較少時，發酵液中酵母菌的密度較大，抑制了酵母菌的生長，乙醇含量較低；當含水量超過35%(料液比為1∶35)時，由于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液用量過多造成發酵液中酵母菌濃度降低，且發酵液體積大容易染菌、酵母菌與還原糖接觸的概率降低等原因導致乙醇含量下降。因此，料液比以1∶35較為適宜。

從圖4d可以看出，隨著轉速的增大，乙醇含量呈先升高后降低的趨勢；在轉速為140 r·min-1時，乙醇含量達到最高，為8.32 g·L-1。這是因為，在一定范圍內轉速的增大為發酵提供了更多的溶氧，為纖維素酶和蘆葦秸稈的充分接觸提供了有利條件，也為培養基提供了更多的溶氧，促進了酵母菌的生長，進而積累了更多的乙醇。因此，轉速以140 r·min-1較為適宜。

從圖4e可以看出，隨著發酵時間的延長，乙醇含量不斷升高；當發酵時間超過72 h后，乙醇含量趨于穩定，可能是因為還原糖被完全消耗。因此，發酵時間以72 h較為適宜。

從圖4f可以看出，隨著發酵溫度的升高，乙醇含量呈先升高后降低的趨勢；在發酵溫度為32 ℃時，乙醇含量達到最高，為8.02 g·L-1。這是因為，發酵溫度較低時，酵母菌活性低，且纖維素酶糖化速率慢，導致糖供給不足影響了乙醇含量；雖然在較高的發酵溫度下，纖維素酶能更有效地促進蘆葦秸稈纖維素糖化，但會影響酵母菌活性。因此，發酵溫度以32 ℃較為適宜。

2.5.2 PB實驗結果

PB實驗設計與結果見表2，結果分析見表3。

表2 PB實驗設計與結果

表3 PB實驗結果分析

從表2、表3可以看出，6個因素對乙醇含量影響的大小順序為：發酵時間>混合酵母接種量>發酵溫度>料液比>纖維素酶用量>轉速；其中發酵時間、混合酵母接種量和發酵溫度對乙醇含量的影響較大，且這3個因素對乙醇含量的影響均呈正效應，效應大小順序為：發酵時間>混合酵母接種量>發酵溫度。

2.5.3 最陡爬坡實驗結果

采用最陡爬坡實驗快速獲得最大乙醇含量區域，有效建立響應面擬合方程。最陡爬坡實驗設計與結果見表4。

表4 最陡爬坡實驗設計與結果

從表4可以看出，當混合酵母接種量為12%、發酵時間為72 h、發酵溫度為34 ℃時，乙醇含量達到最高，為9.65 g·L-1。

2.5.4 響應面實驗結果

在PB實驗的基礎上，以最陡爬坡實驗確定的混合酵母接種量12%、發酵時間72 h、發酵溫度34 ℃作為中心點，采用Box-Behnken設計響應面實驗，因素與水平見表5，結果見6，方差分析見表7。

用Design-Expert軟件對響應面實驗結果進行二次多項回歸擬合，得回歸方程為：Y=-2345.18306+37.28339A+57.22313B+4.95892C+0.10856AB-0.12215AC+0.027879BC-1.84015A2-0.41166B2-0.082820C2。

從表7可以看出，模型F值為22.64，P值為0.000 2，表明模型有效；模型預測復相關系數R2為0.990 6，精密度為46.981，表明模型數據可信度和精確度高，適應性好，分析結果較為可靠；一次項A對乙醇含量影響顯著，二次項A2、B2和C2對乙醇含量影響極顯著。

表5 響應面實驗的因素與水平

表6 響應面實驗結果

表7 方差分析

2.5.5 響應面分析

響應面圖和等高線圖顯示每個變量對響應值的影響，可以直觀反映各因素之間的交互作用。混合酵母接種量、發酵時間、發酵溫度等3個因素交互作用的響應面圖和等高線圖如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對乙醇含量影響的響應面圖和等高線圖

從圖5可以看出，各等高線圖中心呈橢圓形，表明混合酵母接種量與發酵時間、混合酵母接種量與發酵溫度、發酵時間與發酵溫度之間交互作用明顯；同時，響應面圖開口朝下，表明乙醇含量和3個因素之間呈拋物線關系。

通過響應面分析得到蘆葦秸稈混合發酵制備乙醇的最優條件為：混合酵母接種量12.27%、發酵溫度33.86 ℃、發酵時間72.12 h。考慮實際操作情況，確定最優條件為：混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預處理60目蘆葦秸稈、釀酒酵母與產朊假絲酵母配比3∶2、混合酵母接種量12%、發酵溫度34 ℃、纖維素酶用量12%、轉速140 r·min-1、料液比1∶35(g∶mL)、發酵時間72 h、pH值4.8。

2.5.6 驗證實驗

在最優工藝條件下進行5組平行實驗，得到乙醇含量平均值為9.81 g·L-1，與理論值偏差小于1%，符合預測范圍。因此，該模型可用于優化蘆葦秸稈混合發酵制備乙醇的工藝。

3 結論

以蘆葦秸稈為原料，利用混合堿液對其進行預處理促進秸稈纖維素糖化，在單因素實驗的基礎上，通過Plackett-Burman(PB)實驗、最陡爬坡實驗和響應面實驗確定了混合酵母發酵制備乙醇的最優工藝為：混合堿液(NaOH∶尿素=3.85∶1)預處理60目蘆葦秸稈、釀酒酵母與產朊假絲酵母配比3∶2、混合酵母接種量12%、發酵溫度34 ℃、纖維素酶用量12%、轉速140 r·min-1、料液比1∶35(g∶mL)、發酵時間72 h、pH值4.8，在此條件下，乙醇含量達到9.81 g·L-1。