多指標正交試驗法優(yōu)選葛根不同切制工藝研究

★ 鄧小燕 鐘凌云 朱衛(wèi)豐 于歡 諶瑞林 廖晶晶 丁星月（.江西中醫(yī)藥大學 南昌330004；.江西江中中藥飲片有限公司 江西 九江 33300）

葛根為豆科多年生藤本植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，主產于河南、陜西、廣東等地，味甘、辛，性涼，為不規(guī)則厚片、粗絲或邊長為5～12 mm的小方塊，具有疏散退熱，透疹，生津止渴，升陽止瀉，伸經活絡，解酒毒等功效［1］。目前市場上葛根丁塊多為1 cm的不規(guī)則丁塊，葛根厚片則根據原藥材的粗細被切成斜片或直片，藥房和醫(yī)院為了便于調劑和煎煮，一般選用葛根丁塊，只有少部分藥企會選擇葛根厚片，葛根丁塊、厚片的使用比例大概是9∶1。有大量研究表明，飲片切制規(guī)格的不同對其有效成分的含量及藥效具有顯著的影響［2-5］，但目前未見對葛根不同切制規(guī)格飲片進行比較的系統研究報道。因此，本實驗擬開展葛根不同切制規(guī)格飲片的系統研究，首先就是對其不同切制規(guī)格的飲片工藝進行優(yōu)選，為后續(xù)的深入研究制備標準樣品，為今后進一步規(guī)范和提高葛根飲片質量，提高葛根飲片臨床療效奠定基礎。

葛根主要活性成分為異黃酮類，其中最主要的有效成分為葛根素［6］，張文軍［7］研究表明，藥材浸出物的含量可以作為其質量標準的內容，而中藥煎煮是患者選擇中醫(yī)中藥治療服藥前的最后一個、也是至關重要的環(huán)節(jié)，但是目前包括《中國藥典》在內的大部分規(guī)范及研究中并未見葛根煎出物指標，鐘燕珠等［8］認為，藥材的切制規(guī)格對其煎出量具有明顯的影響，故本研究在考察葛根不同規(guī)格切制工藝中增加了煎出物這一指標。

本實驗采用正交試驗法,以切制厚度（片型飲片）/粒徑（丁塊飲片）、干燥時間、干燥溫度為考察因素，以葛根浸出物、葛根素含量、煎出物作為優(yōu)選指標，分別對葛根丁塊、厚片的切制工藝進行考察，用加權法平均優(yōu)選出葛根片/丁塊的最佳切制工藝，為葛根的進一步研究和臨床使用提供依據和參考。

1 儀器與試藥

ZNHW型電熱套（鞏義市予華儀器有限責任公司）；waters2695高效液相色譜儀,檢測器為紫外檢測器；葛根素對照品（批號：10171-201303，南昌貝塔生物科技有限公司）。葛根原藥材（批號：20180810,購于湖北黃岡），經江西中醫(yī)藥大學葛菲教授鑒定為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根。無水乙醇（分析純，西隴科學股份有限公司），甲醇（色譜純，美國天地有限公司），磷酸（西隴科學股份有限公司），水為超純水。

2 方法與結果

取葛根原藥材，擬采用正交設計法優(yōu)選工藝，以切制厚度/粒徑、干燥時間、干燥溫度為考察因素，以葛根浸出物、葛根素含量、煎出物作為優(yōu)選指標，分別對葛根丁塊、厚片的切制工藝進行考察。

2.1 葛根不同切制工藝樣品的制備 按照因素水平表（表1～2），以切制粒徑/厚度、干燥時間、干燥溫度為考察因素，依據正交表，依次得到葛根丁塊、葛根厚片各9種不同切制工藝樣品。

表1 葛根丁塊不同切制工藝正交試驗因素水平表

表2 葛根厚片不同切制工藝正交試驗因素水平表

2.2 葛根不同切制工藝樣品浸出物測定［1］將不同切制工藝葛根樣品打粉，過二號篩。取粉末2 g，精密稱定，置于250 mL錐形瓶中，精密加入50 %的乙醇50 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，得出浸出物含量。

2.3 葛根不同切制工藝樣品煎出物的測定［9］取葛根丁塊及厚片不同切制工藝干燥樣品5 g，分別加10倍量水浸泡0.5 h后煎煮并保持微沸30 min，過濾至已經恒重的蒸發(fā)皿中，再加入8倍量水煎煮并保持微沸20 min，濾過，合并兩次濾液，回收多余水分得浸膏，放105 ℃中干燥3 h后冷卻，稱重，計算得煎出率。

2.4 葛根素含量測定

2.4.1 色譜條件 Waters SymmetryC18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相為甲醇-0.2 %磷酸,流速為1 mL/min,檢測波長為250 nm，柱溫為25 ℃。理論塔板數按葛根素峰計算應不少于4 000，色譜圖見圖1。

圖1 葛根炮制品及標準品的葛根素HPLC圖

2.4.2 線性關系考察 精密吸取上述標準品溶液66、166、333、500、666、1 000 μL 分別置 1 mL容量瓶中，精密加入30 %乙醇至刻度，搖勻后進樣，進樣量為10 μL，色譜條件如“2.4.1”，X為葛根素濃度（mg/mL）,Y為葛根素峰面積,用Excel軟件繪制標準曲線并計算線性范圍。得回歸方程Y= 4×107X-327319（R2= 0.999 8）,線性范圍為1.5～7.5 mg/mL。葛根素的含量測定經方法學考察符合測定要求。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取葛根素標準品溶液10 μL，重復進樣 6次,考察葛根素色譜峰的相對保留時間及相對峰面積的一致性。測得葛根素峰面積 RSD=0.8 %,表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復性試驗 精密取同一樣品6份,制得供試品溶液,分別進樣10 μL,測得葛根素峰面積RSD=0.7 %（n=6），表明該法重復性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液,每次進樣10 μL,每1 h進樣1次,連續(xù)6次。考察葛根素色譜峰的相對保留時間及相對峰面積在6 h內的穩(wěn)定性。測得葛根素含量RSD＝0.35 %（n=6），表明供試品溶液中葛根素在6h內含量穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知葛根素含量的葛根粉末（葛根素含量為5.04 %）約100 mg,加5.0 mL葛根素對照品溶液（0.1 mg/mL）,計算加樣回收率。結果葛根素的平均回收率為99.01 %，RSD=4.55 %。

2.4.7 標準品溶液的測定 精密稱定葛根素標準品7.5 mg，置5 mL的容量瓶中，加30 %乙醇制成每1.5 mg/mL的溶液，搖勻。進樣量為10 μL，色譜條件如“2.4.1”。

2.4.8 供試品葛根素的測定 精密稱定葛根樣品粉末（過三號篩）約0.1 g，置150 mL具塞錐形瓶中，用移液管精密加入30 %乙醇50 mL，稱定重量，至水浴鍋中加熱回流30 min，待冷卻后稱重并補足減少的30 %乙醇溶液，搖勻后過濾，取濾液，進樣量為 10 μL，色譜條件如“2.4.1”。

2.5 正交試驗結果分析 利用綜合加權評分法確定最佳的炮制方法。具體權重為：葛根素為主要有效成分，其含量占權重40 %；浸出物和煎出物為評價飲片質量的重要指標，其含量各占權重30 %。打分方法為：各指標均為越高越好，故以含量最高的樣品為100分，將各值換算成相應的分數，以此分數為基礎，進行正交試驗數據處理。

綜合評分=（A/42.05）×0.3+（B/33.9）×0.3+（C/7.59）×0.4

式中A代表浸出物含量；B代表煎出物含量；C代表葛根素含量算得總分,見表3-5。

表3 葛根丁塊不同切制工藝正交試驗安排及結果

表4 葛根丁塊正交試驗方差分析

表5 葛根厚片不同切制工藝正交試驗安排及結果

表6 葛根厚片正交設計方差分析

表7 葛根丁塊、厚片不同切制工藝三個指標總平均值

由表3中極差R值及方差結果可知,影響葛根丁塊質量的各因素作用的主次順序為A＞C＞B,即切制粒徑為主要影響因素，干燥溫度為次要影響因素，干燥時間為最次要影響因素，表4中P＞0.05可見A、B、C三個因素對試驗結果均無顯著性意義，按照綜合加權評分值越大越好的原則,最優(yōu)組合為A2B3C1，即葛根丁塊切制粒徑為7～8 mm,干燥溫度為60 ℃，干燥4 h；由表5中極值R可以看出，影響葛根厚片各因素作用的主次順序為C≈B＞A，即干燥時間和干燥溫度的影響力接近，切制厚度為次要影響因素，由表6可知， A、B、C三個因素對試驗結果均無顯著性意義，按照綜合加權評分值越大越好的原則，最佳水平組合為A3B2C1，即葛根厚片厚度為4～5 mm,干燥溫度為55 ℃，干燥1 h。

2.6 最佳方案的驗證試驗 分別取葛根100 g，按照“A2B3C1”和“A3B2C1”進行處理，重復3次，試驗結果見表8、9。

表8 葛根丁塊驗證試驗結果 %

表9 葛根厚片驗證試驗結果 %

2.7 討論 葛根作為一味臨床上十分常用的飲片，目前2015版《中國藥典》尚未對其切制參數規(guī)范化，因此市場上葛根飲片規(guī)格不一，對葛根飲片的質量和臨床使用療效穩(wěn)定產生了一定的影響，本試驗旨在利用正交試驗考察并明確葛根的切制工藝參數，為葛根飲片的優(yōu)化和質量的提高提供試驗參考和依據，同時，為葛根作用機制的深入研究奠定基礎。

本研究可知，在醇溶性浸出物和水溶性煎出物方面，丁塊較厚片分別提高3.02 %和1.38 %，或與葛根厚片較丁塊表面積更大，隨著干燥溫度和干燥時間的增加導致成分的散失增加有關，而在葛根素的含量方面，厚片和丁塊的含量未有顯著性差異，綜合可見，丁塊較優(yōu)于厚片；由表3可知，水溶性煎出物與丁塊的表面積有關，表面積越小，煎出的效果越好，而醇溶性浸出物并不隨著表面積的變小而提高，由此可以得出，水溶性煎出物和醇溶性浸出物并不絕對隨著藥材的表面積的減小而增大，或與其含有的淀粉等其他成分有關，綜上由可得，飲片并非切的越薄越好，其質量與有效成分，與溶媒的接觸面積等均有一定關系。

試驗結果表明，影響丁塊質量的主要因素為切制粒徑的大小，干燥溫度為次要影響因素，干燥時間為最次要影響因素，研究發(fā)現，當葛根丁塊粒徑為7～8 mm,干燥溫度為60 ℃，干燥時間為4h時飲片質量最佳；影響厚片的主要因素為干燥時間和干燥溫度，切制厚度為次要影響因素，研究發(fā)現，當葛根厚片厚度為4～5 mm,干燥溫度為55 ℃，干燥時間為1 h時飲片質量最佳，且葛根丁塊質量較優(yōu)于葛根厚片，建議推廣應用。

葛根切制工藝受眾多因素影響，如軟化時原藥材的大小、軟化時用水溫度和體積以及天氣溫度、濕度等影響，且由于葛根干燥根質地堅硬，所需軟化時間較長，因此，葛根多在產地加工中將藥材趁鮮切制，后續(xù)將對趁鮮切制飲片和原藥材軟化后切制飲片進行相關的比較分析，對于進一步明確葛根切制工藝和規(guī)格，闡明其炮制原理，提升葛根飲片質量等具有重要意義。