復方生地提取液對銀屑病模型小鼠炎癥水平的影響

★ 李雄英 艾瑛 徐云 鄒立君 何平平 劉少雄 王英（江西中醫藥高等?？茖W校 江西 撫州344000）

銀屑病是一種以角質形成細胞過度增生、炎癥細胞浸潤和新生血管形成為主要組織病理改變的慢性炎癥性皮膚病，其患病數占全世界皮膚病患病總數的0.4 %～0.6 %，占自然人群患病總數的0.1 %～0.3 %［1］。該病極易復發且難以根治，是皮外科重點研究疾病之一［2-4］，目前用于系統治療銀屑病有效的西藥制劑主要有細胞毒及免疫抑制劑、維甲酸類、抗生素類及生物制劑等［5-6］，但依然不能根治或導致多種毒副作用，因此積極研究高效、低毒副作用的治療銀屑病的藥物制劑具有重要意義。復方生地提取液用于血熱型銀屑病的治療已取得了滿意的臨床療效，但其主要藥效學基礎及可能作用機制不明確。本實驗采用注射己稀雌酚制備銀屑病模型，觀察復方生地提取液對模型小鼠陰道細胞有絲分裂影響，并進一步檢測血液炎癥因子探討其可能的作用機制，為其臨床用藥提供一定藥理學依據。

1 實驗材料

1.1 動物 雌性ICR小鼠72只，6～8周齡，SCXK（浙）20080033，合格證號：0019405，由浙江省醫學科學院實驗動物中心提供。

1.2 藥物及其配制 造模材料：己烯雌酚批號（20131001）、秋水仙堿批號（20140210）；受試藥：復方生地提取液配制成低、中、高三種劑量（0.02、0.04、0.08 g/kg），由杭州市第三人民醫院提供（批號：140320）；陽性對照藥：復方青黛膠囊批號（140403），用前配成0.4 mg/mL，備用。

1.3 實驗試劑 無水乙醇（批號20140725，杭州龍山精細化工有限公司）；95%乙醇（批號140803601，安徽安特食品股份有限公司）；二甲苯批號（20140901，中國杭州化學試劑有限公司）；鹽酸批號（20130621，衢州巨化試劑有限公司）；氨水批號（20091022，杭州長征化學試劑有限公司）；中性樹脂批號（20130830，中國上海標本模型廠）；伊紅批號（20140919，南京建成科技有限公司）；蘇木批號（20141014，南京建成科技有限公司）；蓋玻片批號（10212450C，江蘇世泰實驗器材有限公司）；石蠟（批號20140516，上海華靈康復機械廠）。

1.4 儀器 MEIKO EC360包埋機（美康儀器設備制造高淳縣有限公司）；自動脫水機（SAKURA Tissue-Tek VIP 5Jr）；LEICARM2245切片機（德國LEICA公司）；ZPJ-1A展片機（d航機械設備廠）；生物顯微鏡B5-223IEP（Motic公司）；Adavance3.2圖像分析系統（Motic公司）；MEIKO FT100展片機（美康儀器設備制造高淳縣有限公司）；DHG-9140烘箱（上海精宏實驗設備有限公司）；生物顯微鏡B5-223IEP（Motic公司）；Adavance3.2圖像分析系統（Motic公司）；載玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）；Microcl17微量離心機（美國Thermo公司）。

2 方法

2.1 動物分組 雌性ICR小鼠72只，6～8周齡，分為6組，分別為正常對照組、銀屑病模型組、復方生地提取液低劑量組（0.2 g/kg）、復方生地提取液中劑量組（0.4 g/kg）、復方生地提取液高劑量組（0.8 g/kg），陽性對照組（復方青黛膠囊），每組12只。

2.2 造模與給藥 除正常對照組小鼠腹腔注射（ip）給予每10 g體重0.1 mL生理鹽水外，其余各組均腹腔注射己烯雌酚10 mg/kg，每日1次，連續3 d（3 d后隔天注射1次，至實驗結束），使小鼠陰道上皮處于增生狀態。除正常對照組和模型組給予生理鹽水外，其余各組于第3天給予相應藥物，每日1次，連續30 d。模型制備參考施惠娟研究氧化苦參堿對銀屑病模型雌激素周期小鼠陰道上皮細胞增殖和凋亡的影響［8］。

2.3 指標測定

2.3.1 小鼠血清炎癥指標的測定 末次給藥后，除正常對照組外，其余各組小鼠腹腔注射秋水仙堿2 mg/kg，使細胞分裂停滯于有絲分裂期。6 h后取血，采用酶勉法測定血清腫瘤壞死因子（TNF-α）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（NOS）、內皮素ET-1、白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、細胞粘附分子（VCAM-1）及血管內皮生長因子（VEGF）水平探討其可能作用機制。

2.3.2 小鼠陰道病理學觀察 取血完畢后，迅速處死小鼠并取陰道組織，放入4 %中性福爾馬林中固定3 d后，經取材-固定-水洗-脫水-包埋-切片-HE染色等步驟制備陰道病理學切片，在光學顯微鏡下觀察陰道細胞的有絲分裂，并計數100個陰道基底細胞中所出現的有絲分裂細胞數，即基底層細胞有絲分裂指數。

3 統計學方法

4 實驗結果

4.1 對銀屑病模型小鼠血清炎癥因子的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠炎癥因子血清腫瘤壞死因子（TNF-α）、血清白介素-8（IL-8）、血漿細胞粘附分子（VCAM-1）、血漿血管內皮生長因子（VEGF）水平明顯升高（P＜0.05,0.01）。與模型對照組比較，復方生地提取液低、中劑量（0.2 g/kg）能明顯降低模型小鼠血清TNF-α、血漿VEGF水平（P＜0.05，0.01）；高劑量（0.8 g/kg）能明顯降低模型小鼠血清TNF-α、VEGF、IL-8、及VCAM-1水平（P＜0.05，0.01）。提示復方生地提取液對模型小鼠血清炎癥因子有明顯的改善作用。結果見表1。

表1 對銀屑病模型小鼠血清炎癥因子的影響（±s，n=12）

表1 對銀屑病模型小鼠血清炎癥因子的影響（±s，n=12）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型對照組比較，* P＜0.05，**P ＜0.01。

劑量 NO NOS ET-1 TNF-α VCAM-1 VEGF IL-8 IL-2 IL-6組別/g·kg-1 /μmol·L-1 /μm·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 /ng·L-1 （pg/mL）正常對照組 - 39.58±6.15 32.19±5.27 60.99±8.79 127.25±8.88 3.75±0.58 497.56±45.59 118.24±11.26 32.26±1.99 109.33±6.54模型對照組 - 50.07±8.40△△ 41.06±5.48△△ 74.90±8.28△△ 138.50±9.52△△ 4.43±0.38△△ 592.43±62.77△△ 137.18±12.18△△ 35.65±2.85△△ 117.61±5.94△△復方青黛膠囊 0.5 44.06±7.32 37.85±5.19 69.25±9.66 130.34±8.71* 3.78±0.54** 508.01±53.15** 125.15±11.80* 33.64±2.07* 111.92±6.20*復方生地提取液 0.2 43.79±9.07 37.43±5.76 68.16±5.61* 131.42±9.32* 3.98±0.59 526.81±38.49** 131.81±6.61 34.61±1.92 115.45±7.91復方生地提取液 0.4 43.31±6.24* 36.71±5.05* 64.71±9.13* 130.89±9.77* 4.14±0.59 519.03±79.12** 128.63±18.85 34.05±1.33* 113.51±4.99*復方生地提取液 0.8 43.11±10.93* 36.18±4.87* 63.22±9.01* 131.17±8.32* 3.82±0.43** 508.13±34.73** 125.63±14.37* 33.78±1.95* 112.18±7.87*

4.2 對銀屑病模型小鼠陰道病理組織影響 正常對照組小鼠的陰道組織均被覆分化良好的鱗狀上皮，基底層偶見處于核分裂相的細胞。模型對照組小鼠的陰道基底層細胞均增生活躍，有較多細胞核深染，呈不規則的分裂或多核狀態，體積增大，提示模型復制成功，Van Scott［9］提出的腹腔注射己烯雌酚使小鼠陰道上皮處于增生狀態模擬人類銀屑病表皮增生加速特點，可較好地反映細胞增殖情況，施惠娟［8］、劉冬平［10］等均采用此方法制備銀屑病模型小鼠。復方生地提取液組的基底層處于核分裂相的細胞較模型組減少。與正常對照組比較，模型對照組小鼠陰道上皮細胞基底層細胞有絲分裂指數顯著升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，復方生地提取液高（0.8 g/kg）可顯著降低陰道上皮基底細胞的有絲分裂指數（P＜0.05）。提示復方生地提取液可改善模型小鼠銀屑病表皮增生過快病理生理特點。結果見表2、圖1。

表2 對銀屑病模型小鼠陰道細胞有絲分裂指數的影響（±s，n=12）

表2 對銀屑病模型小鼠陰道細胞有絲分裂指數的影響（±s，n=12）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P ＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 給藥劑量/g·kg-1 有絲分裂指數/%正常對照組 - 3.17±0.75模型對照組 - 16.00±7.54△△復方青黛膠囊 - 9.17±3.37*復方生地提取液 0.2 11.00±6.10復方生地提取液 0.4 12.00±5.62復方生地提取液 0.8 8.50±4.09*

圖1 各組小鼠陰道HE染色

5 討論

銀屑病（中醫學稱之為“白疕”）是一種以皮膚代謝發生障礙產生慢性鱗屑性皮損為主要特征的疾病，一旦發作，則紅斑色鮮、肌膚灼熱、瘙癢劇烈且反復難愈。中醫理論認為，銀屑病是由風邪客于皮膚，血燥不能榮養所致。現實生活中外感風邪致風寒或情志內傷致郁結不舒或飲食不節致濕邪內蘊而化熱，最終熱邪蘊于營血，耗傷陰血，血虛風燥而致病，因此銀屑病治療應以清熱涼血、清熱解毒為主要治則。復方生地提取液用于血熱型銀屑病的治療已取得了滿意的臨床療效；復方生地提取液以生地、牡丹皮清熱涼血為君藥；黃芩、金銀花、連翹清熱解毒為臣藥；當歸、赤芍活血祛瘀，茯苓皮利水滲濕共為佐藥；甘草調和為使藥，諸藥合用，共奏清熱涼血、清熱解毒之效。

銀屑病表皮的病理生理主要特點之一為增生過快，而雌激素周期小鼠陰道上皮增生活躍，有絲分裂增多，細胞轉換加快；本實驗采用雌激素己烯雌酚小鼠腹腔注射，模擬了人類銀屑病表皮增生過快的特點，比較小鼠陰道基底細胞有絲分裂指數，可較好地評價藥物抑制細胞有絲分裂作用。實驗結果顯示，復方生地提取液0.8 g/kg能顯著降低模型小鼠陰道有絲分裂指數，抑制雌性小鼠陰道上皮細胞有絲分裂，提示復方生地提取液可改善銀屑病表皮增生過快病理生理特點。

銀屑病是一種以角質形成細胞過度增生、炎癥細胞浸潤和新生血管形成為主要組織病理改變的慢性炎癥性皮膚病，免疫異常及血管增生是銀屑病的重要機理，特別是T淋巴細胞的活化和細胞因子的釋放在銀屑病的發病和維持其基本病理特征方面起關鍵性作用［11］。促炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）、白介素 -6（IL-6）［12］、白介素 -8（IL-8）、白介素 -2（IL-2）［13］等與銀屑病的發生、發展有密切的關系。①腫瘤壞死因子-α是巨噬細胞受到脂多糖(類毒素)等刺激而釋放，可通過誘導蛋白酶抑制劑的表達而影響角阮細胞的再生分化和導致表皮中中性白細胞的浸潤；它還作用于表皮成纖維細胞，使其發生表型改變；另外，TNF-α還可誘導角質形成細胞增加表達細胞問粘著分子-1，從而促進炎性細胞在皮膚的浸潤，進一步產生一系列炎癥反應。②IL-8又名粒細胞趨化蛋白、中性粒細胞激活因子等，在銀屑病的發病機制中充當很強的白細胞趨化劑和Kc的絲裂原，在介導T細胞和中性粒細胞浸潤中可能起關鍵作用；銀屑病患者皮損［14］和血清［15］中有高水平IL-8。③細胞粘附分子（VCAM-1）屬于免疫球蛋白超家族中的一員，能夠促進炎癥細胞在血管內皮沉積和黏附，在炎癥性皮膚病的致病中發揮重要作用，銀屑病患者血漿中有高水平VCAM［16］。④血管異常是銀屑病發生、發展全過程的關鍵，而血管異常是整個免疫系統及各種細胞、炎癥因子表達紊亂的結果。血管內皮生長因子（VEGF）具有促進內皮細胞增生、增加血管通透性、誘導血管生成和參與血管重塑等多種功能，是目前發現的最重要的促血管新生物質之一［17］。實驗結果顯示，復方生地提取液能顯著降低模型小鼠血清腫瘤壞死因子（TNF-α）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（NOS）、內皮素ET-1、白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、細胞粘附分子（VCAM-1）及血管內皮生長因子（VEGF）水平，提示復方生地提取液可能通過調節炎癥水平改善銀屑病。

綜上，復方生地提取液既可抑制表皮增生過快，改善皮損病癥；亦可降低血清促炎癥細胞因子，改善機體炎癥病變，消除病因；對銀屑病模型有較明顯的療效，標本兼治。