尿液細胞來源iPSCs-NSCs聯合3D打印支架移植修復大鼠急性脊髓損傷的研究

李長明 邵榮學 鄧小梅 趙士杰 王拓 全仁夫

急性脊髓損傷（acute spinal cord injury，ASCI）是一種嚴重的中樞神經系統損傷，發病率和致殘率均較高，常導致受損平面以下運動和感覺功能障礙[1]。ASCI 的主要損傷機制包括軸突的失連、神經細胞的凋亡與壞死等。目前尚無有效的方法治療ASCI。近年來，組織工程學的興起為ASCI 的治療提供了新方向，并取得了不少進展[2-3]，其基本思路是生物支架+種子細胞原位移植于受損脊髓處，提供細胞再生的微環境及通路，以期重塑傳導束及促進軸突再生。本研究通過對尿液細胞（urine cell，UC）進行重編程建立誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），并定向分化為神經干細胞（neural stem cells，NSCs），再將3D 打印支架載iPSCs 分化的NSCs 移植至受損脊髓，探討3D 打印支架載UC 來源重編程iPSCs 分化的NSCs 對ASCI大鼠的療效。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和標本 SPF 級8 周齡雄性SD 大鼠42只，體重（200±10）g；SPF 級5 周齡雄性SD 小鼠14 只，體重（21±3）g；均購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。均分籠飼養于屏障環境內，室溫20～25 ℃，12 h 光照/12 h 黑暗交替的環境，自由攝食攝水。操作均嚴格遵守《實驗動物管理條例》的相關規定。采集1 例23 歲健康成年男性的尿液作為實驗標本，經杭州市蕭山區中醫院醫學倫理委員會審批通過，患者簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）（aladdin P133293）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）（ab53554）、微管蛋白（β-tubulin Ⅲ）（ab52623）、生長相關蛋白43（GAP-43）（ab75810）、巢蛋白（Nestin）（OM264981）、FBS（F8687）均購于美國Sigma 公司；神經元特異性烯醇化酶（NSE）（bs-10445R）購于中國Bioss 公司；原代神經元細胞基礎轉染（Amaxa Basic Nucleofector）試劑盒（VPI-1003）購于德國Lonza 公司；ALP 檢測試劑盒（KL-ALP-Ra）購于上海康朗生物科技有限公司；硫酸肝素（QC30767）購于美國GlpBio 公司；牛血清白蛋白（BSA）購于中國AMRESCO 公司；熒光顯微鏡（CKX53）購于日本Olympus 公司；冰凍切片機（CMll00）購于德國Leica 公司；高速冷凍離心機（HC-3018R）購于安徽中科中佳科學儀器有限公司；生物信號采集處理系統（medlab-1）購于南京卡爾文生物科技有限公司；3D 打印機購于杭州捷諾飛生物科技有限公司；冷場發射高分辨掃描電鏡（S-4300）購于日本Hitachi 公司；可控性皮質損傷撞擊儀（mode 6.3）購于美國Custom Design 公司；手術器械購于江蘇魚躍醫療設備股份有限公司。

1.3 UC 來源iPSCs 的分離及鑒定 UC 分離及構建iPSCs 參照Zhou 等[4]的方法。采集1 例23 歲健康成年男性尿液200 ml，進行細胞培養，按1∶2～1∶3 傳代，取第3 代UC 進行轉染，電轉染使用原代神經元細胞基礎轉染試劑盒，培養6～10 d，待iPSCs 克隆出現（細胞出現聚集、核質比增大等變化），用玻璃針收集iPSCs 克隆并按1∶3～1∶5 進行傳代。挑取克隆前1 d 接種飼養層細胞，在顯微鏡下，選取狀態好的單克隆細胞用ALP 檢測試劑盒進行ALP 活性檢測（ALP 染色）。并將1×106個iPSCs 注入5 周齡雄性SD 小鼠背部皮下，HE 染色驗證畸胎瘤的形成。iPSCs 使用4%多聚甲醛室溫下固定15 min，0.25%（V/V）聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）/PBS 透膜10 min，室溫下4%（W/V）BSA 封閉1 h。隨后4 ℃下一抗孵育過夜，室溫下二抗孵育30 min，以4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核。使用的一抗為抗OCT4（1∶350，兔多克隆）、抗NANOG（1∶1 000，兔單克隆）、抗TRA-1-81（1∶100，小鼠單克隆）、抗TRA-1-60（1∶100，小鼠單克隆）。二抗為山羊抗兔Alexa Fluor 488或568、山羊抗鼠Alexa Fluor 647。以DAPI 進行細胞核染色，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.4 iPSCs 向NSCs 的分化及鑒定 將消化下來的iPSCs 集落移至培養皿中，差速貼壁30 min，去除分化細胞及飼養層細胞，收集懸浮細胞集落，用擬胚體（EBs）培養基重懸，轉移至細菌培養皿中懸浮培養，隔天換液；懸浮培養4 d 形成成熟的EBs；應用維甲酸+無血清培養基誘導，在EBs 培養基中誘導培養4 d，換成無血清培養基貼壁培養。篩選培養得到的神經球樣克隆命名為iPSCs-NSCs。取誘導分化好的iPSCs-NSCs 置于含10%FBS 的培養基中培養，培養基先用0.1%明膠包被，采用免疫熒光檢測β-tubulin Ⅲ和GFAP 表達。在培養板中將已爬好細胞的培養皿用4%多聚甲醛固定15 min，在培養皿內滴加5%BSA，37 ℃封閉30 min，移液槍吸掉封閉液，培養皿內滴加一抗Nestin（1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS 沖洗，移液槍吸干培養皿內多余液體后滴加熒光二抗FITC（1∶100），37 ℃孵育45 min，PBS沖洗，滴加DAPI 避光孵育5 min 進行細胞核染色。PBS沖洗多余的DAPI，50%甘油封閉培養皿，熒光顯微鏡下觀察iPSCs-NSCs 特異性標志物Nestin 的表達。

1.5 3D 打印硫酸肝素-膠原蛋白支架 采用3D 打印技術聯合真空冷凍干燥法。取Ⅰ型膠原蛋白100 mg、Ⅱ型膠原蛋白10 mg 和硫酸肝素1 mg，加入PLGA 200 mg，充分混勻，增稠劑提高漿料的黏稠性與穩定性。打開氮氣，將配制好的漿料置于物料桶內，設置好分壓。選擇打印針頭并進行物料出料校準。設置與調節打印參數，包括出料溫度、平臺溫度等。三維支架成型，室溫下放置4 h 以上，45 與60 ℃分別恒溫干燥箱中持續干燥12 h。電鏡下觀察支架形態。

1.6 支架細胞預處理 將3D 支架截成約2～3 mm 的小段，置于干細胞培養基中浸泡48 h 后，在無菌操作臺中風干，滅菌備用。將iPSCs-NSCs 細胞培養至第7 天時，消化計數，將1×106個細胞濃縮為0.2 ml，滴于預處理過的支架上，置于培養箱中2 h 后用于實驗。

1.7 實驗動物分組 42 只8 周齡雄性SD 大鼠按照隨機數字表法分為模型組、支架模型組和iPSCs-NSCs 組3 組，每組14 只。

1.8 ASCI 模型建立 采用改良Allens 法通過可控性皮質損傷撞擊儀（mode 6.3）構建ASCI 模型。常規護理1 周后進行實驗。大鼠麻醉后去除椎板，3 組均切除2～3 mm 長損傷處脊髓，給予不同干預措施。模型組于損傷處滴入DMEM 培養液0.2 ml，支架模型組于損傷處植入載DMEM 培養液的2～3 mm 支架，iPSCs-NSCs 組于損傷處植入載iPSCs-NSCs 的2～3 mm 支架。

1.9 觀察指標

1.9.1 開放領域運動測試（basson beattle bresnahan,BBB）評分 干預1、2、4、6、8 周后，采用BBB 評分評價3 組大鼠關節協調功能，總分為21 分，分數越高，關節協調情況越好。

1.9.2 Tarlov 和Rivlin 評分 干預8 周后，采用Tarlov和Rivlin 評分評價3 組大鼠后肢運動功能，Tarlov 評分總分5 分，Rivlin 評分總分66 分，分數越高，后肢運動功能越好。

1.9.3 神經電生理檢測 干預8 周后，采用生物信號采集處理系統（medlab-1）用電極針進行測定，給予直流方波電脈沖刺激，直至可刺激觀察到后肢輕微抽搐為止，強度為7.5 V，波寬為0.2 ms，頻率為3 Hz，疊加達到50 次。計算機疊加處理測試結果，記錄運動、感覺誘發電位潛伏期長短和振幅的變化，觀察神經電生理學情況。

1.9.4 病理檢查 干預8 周后，10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉后開胸，自左心室插管至主動脈，然后剪開右心耳，先灌注PBS 150 ml，再用含4%中性多聚甲醛的0.9%氯化鈉溶液250 ml 進行心臟灌注、固定。沿原手術正中切口，再次逐層暴露受損節段脊髓組織，切取原損傷區域胸段脊髓，石蠟包埋，連續5 μm 切片。HE 染色，光鏡下觀察3 組大鼠脊髓組織病理學改變情況。

1.10 統計學處理 采用SPSS 16.0 統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；方差不齊時，兩兩比較采用Tamhane's T2 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UC 來源iPSCs 構建 從尿液樣本分離培養UC，結果顯示第3 代UC 呈現纖維樣或上皮樣，狀態良好（圖1a，見插頁）。ALP 染色顯示，UC 來源iPSCs 克隆呈陽性（圖1b，見插頁）。畸胎瘤試驗中，形成的畸胎瘤具有3 個胚層特征：軟骨（中胚層）、腸上皮（內胚層）、神經上皮（外胚層）（圖2）。表明UC 來源的iPSCs 在體內具有向3 個胚層分化的能力，進一步驗證UC 來源iPSCs 的全能性。

圖1 尿液細胞（UC）及誘導性多能干細胞（iPSCs）ALP 染色結果所見[（a：尿液中分離得到的第3 代UC，×25；b：UC 來源的誘導性多能干細胞（iPSCs）ALP 染色呈陽性，×100）]

圖2 畸胎瘤組織切片HE 染色所見[a：腸上皮（內胚層）；b：軟骨（中胚層）；c：神經上皮（外胚層）；HE 染色，×200]

2.2 UC 來源iPSCs 的鑒定 免疫熒光檢測顯示，UC來源iPSCs 表達全能性蛋白OCT4、NANOG、TRA-1-81、TRA-1-60（圖3，見插頁），說明UC 來源iPSCs 呈全能性狀態。

2.3 iPSCs-NSCs 鑒定 免疫熒光顯示iPSCs-NSCs 中Nestin 目的蛋白呈現為綠色熒光，細胞核經DAPI 染色呈現藍色熒光，結合上述細胞形態分析可以鑒定出細胞為iPSCs-NSCs（圖4a，見插頁）。免疫熒光顯示βtubulin Ⅲ目的蛋白呈現為紅色熒光，細胞核經DAPI 染色呈現藍色熒光，細胞大量表達，分化能力良好（圖4b，見插頁）。免疫熒光顯示GFAP 目的蛋白呈現為紅色熒光，細胞核經DAPI 染色呈現藍色熒光，細胞向周圍延伸，分化能力良好（圖4c，見插頁）。

圖3 誘導性多能干細胞（iPSCs）表達全能性蛋白免疫熒光標記結果（a：全能性蛋白OCT4 表達；b：全能性蛋白NANOG 表達；c：全能性蛋白TRA-1-81 表達；d：全能性蛋白TRA-1-60 表達；×200）

圖4 誘導性多能干細胞（iPSCs）-神經干細胞（NSCs）中免疫熒光鑒定結果[a：iPSCs-NSCs 特征性標志物巢蛋白（Nestin）表達；b：iPSCs-NSCs 中微管蛋白（β-tubulin Ⅲ）表達；c：iPSCs-NSCs 中膠質纖維酸性蛋白（GFAP）表達；×100]

2.4 3D 打印支架 3D 打印技術聯合真空冷凍干燥法制造的3D 打印支架具有完美的內部三維立體多孔結構，掃描電鏡顯示支架橫截面呈疏松的多孔狀，孔徑大小在50 μm 左右（圖5）。

2.5 3 組大鼠BBB 評分比較 干預2、4、6、8 周后，iPSCs-NSCs 組大鼠BBB 評分均高于模型組和支架模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而模型組和支架模型組大鼠BBB 評分比較差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表1。

圖5 3D 打印支架（a：3D 打印的支架；b-c：掃描電鏡顯示支架橫截面呈疏松的多孔狀，b×50，c×200）

表1 3 組大鼠BBB 評分比較（分）

2.6 3 組大鼠Tarlov 和Rivlin 評分比較 干預8 周后，iPSCs-NSCs 組大鼠Tarlov 和Rivlin 評分均高于模型組和支架模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而模型組和支架模型組大鼠Tarlov 和Rivlin 評分比較差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表2。

表2 3 組大鼠Tarlov 和Rivlin 評分比較（分）

2.7 3 組大鼠神經電生理檢測結果比較 干預8 周后，iPSCs-NSCs 組大鼠運動和感覺誘發電位潛伏期均短于模型組和支架模型組，運動和感覺誘發電位振幅均大于模型組和支架模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而模型組和支架模型組大鼠運動和感覺誘發電位潛伏期、振幅比較差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表3。

表3 3 組大鼠神經電生理檢測結果比較

2.8 3 組大鼠脊髓組織病理學改變比較 干預8 周后，HE 染色顯示模型組大鼠脊髓組織受損，組織水腫明顯，細胞稀疏（圖6a）；支架模型組大鼠脊髓組織受損程度輕于模型組，組織水腫，細胞稀疏（圖6b）；iPSCs-NSCs 組大鼠脊髓組織生長良好，細胞致密，空泡減小，組織水腫消失（圖6c）。

3 討論

本研究發現，ASCI 大鼠經UC 來源重編程iPSCs-NSCs 聯合3D 支架移植治療后，BBB 評分、Tarlov 和Rivlin 評分均明顯升高，提示UC 來源重編程iPSCs-NSCs 聯合3D 打印支架移植可明顯改善大鼠神經功能的恢復。ASCI 后造成上下行神經傳導束中斷及微環境受損是ASCI 后截癱的根源。因此，如何促進上下行神經傳導束連接及微環境的修復是治療ASCI 的重點。近年來組織工程技術為ASCI 的治療提供了新的思路：良好的生物相容性及合理的支架設計可以為受損軸突提供橋梁，種子細胞依附于橋梁上并增殖，為促進脊髓神經功能的恢復提供了良好的基礎。本研究創新性地利用3D 打印支架將種子細胞修飾后移植于受損脊髓處，結果表明3D 打印支架+iPSCs-NSCs 聯合能明顯促進大鼠運動、感覺功能的恢復和神經元的恢復。

NSCs 是一種多能干細胞，有永久的增殖能力及分化多向性，是理想的種子細胞。NSCs 可分化成星型膠質細胞、少突膠質細胞和神經元，具有神經營養、免疫調節和修復的作用，能促進感覺和認知功能恢復，在治療神經系統疾病中的前景較好[5]。但既往研究中，NSCs多來源于人類胎兒組織或者胚胎干細胞[6-7]，受到倫理學限制難以在臨床中廣泛應用。隨著iPSCs 的出現，研究者們發現iPSCs 可以作為NSCs 的來源，并且在動物實驗中發現iPSCs-NSCs 同樣可以改善ASCI 后運動功能障礙，iPSCs-NSCs 移植到大鼠脊髓受損區域后，在該區域大部分分化成神經元，但是這項技術仍然受制于iPSCs 本身提取效率的低下[8]。雖然目前iPSCs 可以從多種細胞[9-12]中通過重編程獲得，但是大部分方法取樣是損傷性的，導致收集樣本較困難。Zhou 等[4]報道人UC可被誘導為iPSCs，具有無創、費用低的優點。這些細胞大部分保留正常的功能且容易獲得，是進行體外研究的理想細胞來源。因此本研究收集UC 作為細胞來源，誘導iPSCs，并進行畸胎瘤檢測及全能性蛋白免疫熒光檢測，證實了UC 來源iPSCs 具有與胚胎干細胞相似的全能性。本體外實驗中，NSCs 的特征性標志物Nestin表達，證實了iPSCs 向NSCs 的成功分化。GFAP 和βtubulin 分化良好，說明本實驗成功將UC 重編程為iPSCs，并誘導UC 來源iPSCs 分化為NSCs。

圖6 干預8 周后各組大鼠HE 染色結果所見[a：模型組；b：支架模型組；c：誘導性多能干細胞（iPSCs）-神經干細胞（NSCs）組；HE 染色，×100]

生物支架在治療中應確保種子細胞保留在脊髓損傷部位，調節微環境及填充病變腔并誘導其定向生長[13]。傳統支架多采用高溫燒制和模型注塑，精度難以掌控，且不能隨意改變支架的孔隙。近年來3D 打印技術可以通過設置不同參數打印不同規格的支架，且具有成型迅速、個性化需求及規模量產等優點[14-15]。3D 打印支架為中空多孔的結構，為上下行傳導束的重建和軸突生長提供通道并除去物理隔離，對改善受損組織物理微環境有著積極的作用；本研究打印的支架孔隙約為50 μm，不僅可以提供細胞的依附場所，還可以提供細胞增殖的空間。既往研究證實生物支架+種子細胞具有較好的相容性，能促進大鼠運動及感覺的恢復[16-17]。本實驗中iPSCs-NSCs 能在支架孔中黏附、存活以及生長，表明生物支架為iPSCs-NSCs 提供了較好的微環境，促進了神經纖維的再生，因此支架和iPSCs-NSCs 具有較好的相容性，與上述研究結果基本一致。

綜上所述，UC 來源iPSCs-NSCs 聯合3D 打印支架能促進大鼠運動及感覺功能恢復，但目前僅處于基礎實驗階段，應用于臨床還需更多、更大的樣本參與。UC來源iPSCs-NSCs 和3D 打印支架的聯合應用為臨床治療ACSI 提供了更為簡便的方法，且更容易通過倫理學審查。