樟芝多糖通過ROS-NOX2-NLRP1信號減輕皮層神經細胞炎癥損傷的作用研究

沈和平 官俏兵 郝亞南 俞曉翔 王云 翟麗萍 韓晨陽

神經細胞損傷是大腦結構和功能改變的主要原因，而神經細胞損傷最終可以造成認知障礙，甚至發展為阿爾茨海默病、帕金森病等神經退行性疾病[1-2]。在這類疾病中，炎癥因子的產生和釋放是引起神經細胞損傷的主要原因。研究發現脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）誘導后大腦皮質和海馬組織中炎癥因子的表達大量上調[3-4]，此外，LPS 還可以進一步激活小膠質細胞。活性氧（reactive oxygen species，ROS）可以促進神經細胞炎癥的產生，還可以進一步調節下游還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NADPH oxidase 2,NOX2）的表達[5-6]。NOX2 可以調控中樞病理性氧化應激反應，ROS 通過NOX2 進一步促進炎性小體NLRP1激活，而神經細胞的炎癥反應主是NLRP1 介導的[7-8]。因此，ROS-NOX2-NLRP1 軸在神經細胞炎癥反應中有著重要的作用，也是炎癥反應的重要靶點。在ROS 的研究中常用N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）作為抑制劑。樟芝是一種多孔菌科真菌，也是一種食用/醫用兩用的真菌，其含有多種活性物質。前期研究發現樟芝多糖（antrodia camphorata polysaccharide,ACP）對于帕金森病，尤其是神經細胞有著良好的保護作用，其機制和炎癥的調控有關[9-10]。神經細胞損傷是導致帕金森病的重要因素，所以進一步揭示ACP 抑制神經細胞炎癥損傷的機制對于深入了解ACP 的藥理作用有著重要的意義。本研究主要探討ACP 通過抑制ROSNOX2-NLRP1 信號減輕CNC 炎癥損傷的作用和機制。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑 小鼠皮層神經細胞（cortical neuron cell,CNC）（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：CPM143）及其完全培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：CM-M143）；細胞活力CCK-8 檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：CA1210）；Annexin VFITC/PI 流式雙染細胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：CA1220）；ROS 檢測探針DCFH-DA（北京索萊寶科技有限公司，批號：D6470）；ELISA 檢測試劑盒IL-1β、IL-6、TNF-α（南京建成生物工程研究所，批號：H002、H007、H052）；LPS（美國Sigma 公司分裝）；NAC（中國MCE 公司，批號：HY-B0215）；ACP（實驗室自備，純度95%以上）。

1.2 細胞分組及藥物干預 CNC 用完全培養基培養，待細胞生長至對數期，融合70%～80%左右，將細胞用胰蛋白酶消化后分組。在研究ACP 抗炎癥反應作用的實驗中，將CNC 細胞分為對照組、LPS 組、ACP 5 mg/L組、ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L 組。對照組為常規培養的細胞，無LPS 和ACP 干預；LPS 組用0.1 mg/L LPS 誘導細胞炎癥反應；ACP 各組分別使用終濃度為5、10、20 mg/L 的ACP 進行預處理6 h 后，再用0.1 mg/L LPS 誘導細胞炎癥反應。在研究ACP 通過抑制ROS 發揮作用的機制研究中，將CNC 分為LPS 組、NAC 組和NAC+ACP 組。LPS 組用0.1 mg/L LPS 誘導細胞炎癥反應；NAC 組用10 mM NAC 預處理4 h 后，再用0.1 mg/L LPS 誘導細胞炎癥反應；NAC+ACP 組同時用10 mM NAC 和20 mg/L ACP 預處理4 h 后，再用0.1 mg/L LPS誘導細胞炎癥反應。

1.3 細胞活力檢測 采用CCK-8 法。將CNC 接種到96 孔板后，每組細胞設置3 個復孔（以下檢測相同），待藥物干預后，于0、3、6、12、24 h 進行細胞活力檢測。將每孔培養基吸去后再加入100 μl 完全培養基，同時加入10 μl CCK-8 溶液，繼續孵育4 h，待細胞染色后，在450 nm 處檢測吸光度（OD）值，同時設置空白培養基為對照。細胞活力=（OD實驗組-OD對照）/（OD初始-OD對照）×100%。

1.4 細胞凋亡水平檢測 采用Annexin V-FITC/PI 雙染后流式細胞術。將細胞接種到6 孔板中，干預12 h后，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS 清洗后，2 000 r/min離心10 min，收集細胞后用預冷的PBS 重懸，再次2 000 r/min 離心10 min 后用Binding Buffer 進行懸浮，加入5 μl Annexin V-FITC 染色，避光15 h 后，用5 μl PI 染色5 min，上機檢測。

1.5 細胞ROS 水平檢測 采用DCFH-DA 探針。將細胞接種到6 孔板中，藥物干預12 h 后棄去培養基。按照1∶1 000 的比例用無血清培養基稀釋DCFH-DA 探針，每孔加入1 ml 的含DCFH-DA 探針的培養基，在培養箱中繼續孵育30 min。棄去培養基，用無血清培養基洗滌細胞2 次。熒光顯微鏡下觀察細胞染色水平，同時檢測熒光光度值。

1.6 細胞NOX2、NLRP1 蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。藥物干預12 h 后收集細胞，PBS 洗2次后加入1.0 ml 的RIPA 裂解液在冰上裂解30 min，10 000 g 轉速下離心15 min，取上清液進行BCA 試劑盒的蛋白定量檢測。根據分子量不同分別配置8%～12% SDS-PAGE 凝膠，取蛋白液后用5×loading buffer補充體積至20 μl，煮沸8 min 后，80 V 電壓進行電泳，之后轉換為120 V 電壓繼續電泳。將凝膠去除后進行PVDF 膜的轉膜，采用300 mA 恒流轉膜0.5～2 h，PVDF 膜使用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 稀釋一抗，NOX2、NLRP1 的一抗稀釋比例分別為1∶500、1∶500、1∶600，一抗孵育后PVDF 膜用TBST 洗2 次后，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗孵育，二抗稀釋比例為1∶2 000。孵育完成后用化學發光法檢測，采用Image Pro-Plus 6.0 軟件進行光密度的分析，以GAPDH 為內參，結果以目的蛋白與內參蛋白光密度值比值表示。

1.7 細胞IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達水平檢測 根據試劑盒說明書進行標準曲線的測定。CNC 分組培養，在ACP 干預12 h 后收集細胞培養基，培養基在2 000 r/min 離心15 min，除去細胞碎片和懸浮細胞，取上清液，參照ELISA 檢測試劑盒說明書檢測，利用測定的標準曲線計算細胞因子水平。

1.8 統計學處理 采用SPSS 17.0 統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 校正的t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ACP 對于LPS 誘導下CNC 細胞活力的影響 0 h時5 組細胞活力比較差異無統計學意義（P ＞0.05）；而LPS 干預后，與對照組同一時間點比較，LPS 組細胞活力均明顯下調（均P＜0.05）；而ACP 干預后，與LPS 組同一時間點比較，ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L 組細胞活力均明顯上調（均P＜0.05）；且隨著ACP 濃度的升高，細胞活力明顯上調（P＜0.05），見圖1。

2.2 ACP 對于LPS 誘導下CNC 細胞凋亡的影響 對照組、LPS 組、ACP 5 mg/L 組、ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L 組細胞凋亡率分別為（6.43±0.65）%、（58.65±5.54）%、（38.76±4.55）%、（28.65±3.65）%和（18.65±3.11）%。LPS 干預后，與對照組比較，LPS 組細胞凋亡率明顯上調（P＜0.05）；而ACP 干預后，與LPS 組比較，ACP 5 mg/L 組、ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L 組細胞凋亡率均下調（均P＜0.05）；且隨著ACP 濃度的升高，細胞凋亡率明顯下調（P＜0.05），見圖2。

2.3 ACP 對于LPS 誘導下CNC 中ROS 產生及NOX2、NLRP1 蛋白表達的影響 對照組、LPS 組、ACP 5 mg/L組、ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L 組細胞中ROS 的熒光光度值分別為0.03±0.01、0.27±0.08、0.18±0.06、0.11±0.03、0.07±0.01。與LPS 組比較，ACP 5 mg/L 組、ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L 組細胞中ROS 的熒光光度值均降低（均P＜0.05）；且隨著ACP 濃度的升高，細胞中ROS 的熒光光度值明顯降低（P＜0.05），見圖3（插頁）。與對照組比較，LPS 組NOX2 和NLRP1 蛋白表達水平均升高（均P＜0.05）；經ACP 干預后，與LPS 組比較，ACP 5 mg/L 組、ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L 組NOX2和NLRP1 蛋白表達水平均降低（均P＜0.05），見圖4。

圖1 樟芝多糖（ACP）對于脂多糖（LPS）誘導下皮層神經細胞（CNC）細胞活力的影響（與對照組同一時間點比較，*P＜0.05；與LPS 組同一時間點比較，△P＜0.05）

圖2 樟芝多糖（ACP）對于脂多糖（LPS）誘導下皮層神經細胞（CNC）細胞凋亡的影響

圖4 樟芝多糖（ACP）對于脂多糖（LPS）誘導下皮層神經細胞（CNC）中NADPH 氧化酶2（NOX2）、NLRP1 蛋白表達的影響（a：各組細胞NOX2 和NLRP1 蛋白表達的電泳圖；b：各組細胞NOX2和NLRP1 蛋白表達水平比較，與對照組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，△P＜0.05）

圖3 樟芝多糖（ACP）對于脂多糖（LPS）誘導下皮層神經細胞（CNC）中活性氧（ROS）的產生的影響

2.4 ACP 對于LPS 誘導下CNC IL-1β、IL-6 和TNF-α水平的影響 與對照組比較，LPS 組IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平均升高（均P＜0.05）；經ACP 干預后，與LPS組比較，ACP 5 mg/L 組、ACP 10 mg/L 組和ACP 20 mg/L組IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平均降低（均P＜0.05）；且隨著ACP 濃度的升高，IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達水平均下降（均P＜0.05），見圖5。

圖5 樟芝多糖（ACP）對于脂多糖（LPS）誘導下皮層神經細胞（CNC）IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響（與對照組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，△P＜0.05）

2.5 NAC 抑制ROS 后，ACP 對于CNC 細胞凋亡的影響 LPS 組、NAC 組和NAC+ACP 組細胞凋亡率分別為（56.98±6.54）%、（28.54±4.23）%和（24.63±3.65）%。與LPS 組比較，NAC 組和NAC+ACP 組細胞凋亡率均下調（均P＜0.05）；而NAC 組和NAC+ACP 組細胞凋亡率比較差異無統計學意義（P ＞0.05），見圖6。

2.6 NAC 抑制ROS 后，ACP 對于ROS 產生及NOX2、NLRP1 蛋白表達的影響 LPS 組、NAC 組和NAC+ACP組細胞中ROS 的熒光光度值分別為0.30±0.04、0.07±0.01、0.06±0.01。與LPS 組比較，NAC 組和NAC+ACP 組細胞中ROS 的熒光光度值均降低（均P＜0.05）；而NAC和NAC+ACP 組細胞中ROS 的熒光光度值比較差異無統計學意義（P ＞0.05），見圖7（插頁）。與LPS 組比較，NAC 組和NAC+ACP 組NOX2 和NLRP1 蛋白表達水平均降低（均P＜0.05）；而NAC 組和NAC+ACP 組NOX2 和NLRP1 蛋白表達水平比較差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見圖8。

2.7 NAC 抑制ROS 后，ACP 對于CNC IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響 與LPS 組比較，NAC 和NAC+ACP組IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達水平均降低（均P＜0.05）；而NAC 組 和NAC+ACP 組IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達水平比較差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見圖9。

圖6 N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制活性氧（ROS）后，樟芝多糖（ACP）對于皮層神經細胞（CNC）細胞凋亡的影響（LPS 為脂多糖）

圖7 N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制活性氧（ROS）后，樟芝多糖（ACP）對于ROS 產生的影響（LPS 為脂多糖）

圖8 N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制活性氧（ROS）后，樟芝多糖（ACP）對于NADPH 氧化酶2（NOX2）、NLRP1 蛋白表達的影響[a：各組細胞NOX2 和NLRP1 蛋白表達的電泳圖；b：各組細胞NOX2 和NLRP1 蛋白表達水平比較，與脂多糖（LPS）組比較，*P＜0.05]

圖9 N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制活性氧（ROS）后，樟芝多糖（ACP）對于皮層神經細胞（CNC）IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響[與脂多糖（LPS）組比較，*P＜0.05]

3 討論

神經細胞損傷是多種類型神經系統疾病的重要事件，在阿爾茨海默病、帕金森病、多發性硬化癥以及腦缺血疾病中，神經細胞損傷都可以造成中樞不可逆轉的傷害，而在損傷的機制研究中，氧化應激、線粒體功能損傷、慢性炎癥等都可以造成神經細胞的損傷[11-12]。ROS 目前被認為是氧化損傷的重要因素。ROS 是正常的代謝產物，其中包括超氧陰離子、羥基自由基以及氧自由基等。細胞的ROS 主要有外源性和內源性兩種，內源性ROS 主要由線粒體呼吸鏈NOX 系統產生[13]。線粒體作為ROS 的主要來源，可以產生大多數ROS。線粒體電子傳遞鏈主要由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸酶、琥珀酸氧化還原酶、細胞色素C 還原酶等構成。NOX 是一種跨膜的酶復合物，其中NOX2 主要表達于吞噬細胞、神經細胞以及心機細胞[14-15]。在人的神經組織，包括海馬區、脊髓、皮質區等都有NOX2 的表達。NOX2 在正常生理環境下保持動態平衡，而接受外界信號后可以迅速產生ROS，造成細胞內NOX2 濃度的升高，ROS增高主要可以介導炎癥反應的發生[16-17]。ROS 主要可以通過酪氨酸磷酸化系統、轉錄因子家族、絲裂原活化蛋白激酶等刺激炎癥的產生。目前ROS 被認為可以激活炎性小體的產生。NLRP1 是一種炎性小體，主要包括感受器NLRP1、凋亡相關斑點樣蛋白以及效應蛋白Caspase-1，3 種蛋白相互作用形成高分子的蛋白復合體，激活Caspase 加速，迅速進行炎癥因子IL-1β、IL-6的切合，并釋放到細胞外。研究發現NLRP1 在神經細胞損傷中發揮著重要的作用[18]。

ACP 是一種復合的多糖類化合物，課題組前期的研究中已經發現ACP 對于帕金森病等有著良好的治療效果，其作用和炎癥因子的調控有關[9-10]。而本研究主要以CNC 為對象，深入研究了ACP 的作用，結果發現LPS 誘導的神經細胞炎癥模型中，ROS-NOX2-NLRP1 軸是激活的，ROS 水平迅速上調，可以誘導下游NOX2 和NLRP1 激活，這是神經細胞炎癥反應的主要信號軸。而ACP 干預后，可以抑制ROS 的產生，探針檢測結果也顯示，ROS 熒光光度值下調，而NOX2 和NLRP1 蛋白表達也下調。雖然ACP 的干預抑制了ROS-NOX2-NLRP1軸，可以使細胞活力上調，細胞凋亡水平和炎癥因子表達水平下調。但還需要進一步研究ACP 的具體作用機制，所以筆者采用NAC 進行處理。NAC 是一種ROS 的特異性抑制劑，可以抑制ROS 的產生。在此基礎上將NAC 和ACP 聯用，結果顯示NAC 可以抑制ROS 的產生，從而抑制NOX2 和NLRP1 的激活。但是NAC 和ACP聯用后，對比單一NAC 未見統計學差異。因此，筆者推測ACP 主要抑制了ROS 的產生，從而抑制下游NOX2-NLRP1 軸，改善了神經細胞的炎癥損傷。

綜上所述，ACP 可以通過抑制ROS 的表達抑制NOX2-NLRP1 激活，從而減輕CNC 的炎癥反應。