N-乙酰半胱氨酸對感染性休克小鼠肺損傷保護作用的研究

黃曉軍 陳茜圓 任卓超 金興

感染性休克患者平均死亡率高達42.9%，是重癥患者的首要致死原因[1-2]。感染性休克過程中，誘發大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和炎性介質釋放，導致全身炎癥反應綜合征的發生，出現多器官功能不全甚至多系統器官功能衰竭[3]。感染性休克會導致嚴重的肺損傷，發生急性呼吸衰竭。大量研究顯示，氧化應激在感染性休克發生、發展過程中起到重要作用[4-6]。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）前體，具有很強的抗氧化、抗自由基作用[7-8]。本研究擬評價NAC 能否通過抗氧化應激、抗炎作用，起到減輕感染性休克小鼠肺損傷的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 6～8 周雄性SPF 級C57BL/6 小鼠30只，由江蘇集萃藥康生物公司提供。在屏障環境下飼養，室溫20～25 ℃，12 h 光照/12 h 黑暗交替，均自由攝食攝水。操作均嚴格遵守《實驗動物管理條例》的相關規定。

1.2 實驗試劑 脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）（L2880）、NAC（A7250）均購自美國Sigma 公司；丙二醛（malondialdehyde,MDA）試劑盒（A003-1-2）購自南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）試劑盒（KGT001100-2）、TNF-α 試劑盒（KGEMC102a-1）及IL-6 試劑盒（KGEMC004-1）均購自南京凱基生物科技公司。

1.3 動物分組及模型制作 采用隨機數字表法將小鼠分為對照組、模型組和NAC 干預組3 組，每組10 只。模型組和NAC 干預組腹腔注射LPS（25 mg/kg，溶于0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液）制備內毒素誘發感染性休克模型[9]，對照組則腹腔內注射等量0.9%氯化鈉注射液。NAC 干預組注射LPS 后即刻腹腔注射NAC（300 mg/kg，溶于0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液）[10]，而對照組和模型組腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。6 h 后處死小鼠，并立即取出肺組織。

1.4 肺組織形態學變化觀察 取部分右肺組織，10%甲醛固定后，經梯度乙醇脫水，二甲苯處理后，常規石蠟包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察肺組織形態學變化。根據肺泡腔及間隔炎癥細胞滲出情況（0～3 分）、肺泡間隔增寬情況（0～3 分）、肺泡腔出血情況（0～3 分）、肺泡纖維蛋白滲出情況（0～3 分）進行評分，4 項總分為肺組織病理損傷評分[11-12]。

1.5 肺組織中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量、SOD 活性測定 取左肺組織制備10%組織勻漿，按照試劑盒說明書，采用ELISA 法測定肺組織中炎癥介質IL-6、TNF-α 水平，采用比色法測定肺組織中氧化應激產物MDA 含量和抗氧化酶SOD 活性。

1.6 統計學處理 采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以表示，方差齊時，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；方差不齊時，多組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織形態學變化 光鏡下，對照組肺組織結構清晰，肺泡間隔無增寬，可見少量炎性細胞浸潤；模型組肺組織損傷明顯，肺泡間隔增寬，肺間質及肺泡腔可見大量炎性細胞；NAC 干預組相對模型組肺損傷程度減輕，見圖1。對照組、模型組和NAC 干預組肺組織病理損傷評分分別為（1.07±0.30）、（7.31±1.10）和（5.57±0.88）分，3 組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組和NAC 干預組肺組織病理損傷評分均升高（均P＜0.05）；與模型組比較，NAC 干預組肺組織病理損傷評分降低（P＜0.05）。

2.2 3 組小鼠肺組織中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量和SOD 活性比較 與對照組比較，模型組和NAC 干預組小鼠肺組織中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量均升高，SOD 活性降低（均P＜0.05）；與模型組比較，NAC 干預組小鼠肺組織中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量均降低，SOD 活性升高（均P＜0.05），見表1。

3 討論

本研究以腹腔注射LPS 制備內毒素誘發感染性休克模型，該模型已很成熟，筆者也在前期的研究中反復證實了該模型的可靠性。本研究通過NAC 干預感染性休克小鼠模型，結果表明，NAC 可減輕LPS 誘導的感染性休克小鼠肺損傷的嚴重程度，可使肺組織中SOD 活性升高，IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量均降低。SOD 是一種抗氧化酶，它可以清除氧化應激過程中產生的過多ROS，對機體起到非常重要的保護作用。MDA 是氧化應激過程中產生的高細胞毒性物質，MDA 對機體的危害極大，它與蛋白質、酶發生交聯反應而影響其功能。說明NAC 可以通過其抗氧化和抗炎作用，起到保護感染性休克小鼠肺損傷的作用。

圖1 3 組小鼠肺組織病理切片所見[a：對照組；b：模型組；c：N-乙酰半胱氨酸（NAC）干預組；HE 染色，×200]

表1 3 組小鼠肺組織中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量和SOD 活性比較

NAC 作為祛痰劑應用于臨床多年。近年研究表明，NAC 具有很強的抗氧化、去除自由基作用。NAC 的抗氧化應激作用在國內外許多研究中均得到了證實。Hegab 等[13]在“NAC 和金雀異黃素對吲哚美辛誘導的胃損傷模型的保護作用”的研究中發現，NAC 預處理可明顯改善潰瘍指數，增加NO 水平和SOD 活性，同時明顯降低MDA、TNF-α 水平和髓過氧化物酶（MPO）活性。Maheswari 等[14]在“評估NAC 對卡馬西平引起的肝毒性的肝保護作用”研究中觀察到，NAC 可使GSH 升高，脂質過氧化反應水平降低，并逆轉卡馬西平誘導的組織病理學異常。Hu 等[15]研究表明，NAC 可降低非肥胖糖尿病/嚴重聯合免疫缺陷小鼠骨髓中的ROS 水平。

感染性休克是重癥患者死亡的首要原因，雖然現今的醫療手段已有很大的提高，但其死亡率仍居高不下。研究表明，感染性休克中機體產生的過多ROS 在全身炎癥反應綜合征、多器官功能不全的發生和發展過程中起重要作用，因此認為感染性休克是一種高氧化應激疾病[3]。肺是機體通氣和氧氣交換器官，肺組織氧含量高，因此肺臟也是最容易受到ROS 損害的臟器。感染性休克會導致嚴重的肺損傷，發生急性呼吸衰竭。轉錄因子NF-E2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor2，Nrf2）在機體抗氧化應激中起到重要的保護作用。正常生理情況下，Nrf2 同胞質蛋白伴侶分子Keap1 偶聯，Nrf2 的生物活性受到抑制；當機體產生大量ROS，處于氧化應激狀態時，Nrf2 會從Keap1 解離出來并進入細胞核，激發細胞內抗氧化反應元件調控的相關抗氧化和抗炎基因的表達，從而起到對機體的保護[16-17]。NAC 對感染性休克小鼠的肺損傷保護作用可能與其激活Nrf2 有關[18-19]，NAC 通過上調Nrf2，激活相關抗氧化基因的表達，使肺組織中抗氧化指標升高，氧化應激損傷指標和炎癥介質水平降低，從而起到減輕感染性休克小鼠肺損傷的作用。

綜上所述，NAC 可通過抗氧化應激及清除氧自由基相關物質，從而對內毒素誘發感染性休克小鼠肺損傷起到保護性作用。但感染性休克是一種全身性疾病，可以導致肺、肝、腎、心臟等多臟器功能異常。NAC 能否對其他臟器產生保護作用、改善感染性休克總體預后有待進一步研究；如何優化NAC 的用藥方式有待進一步研究和探討。