花生胚小葉再生體系的建立

馬倩 馬瑩瑩 高古腔 朱樹良 屈成鑫 鞏方平 任銳 李忠峰 馬興立 張幸果 殷冬梅

摘要：本研究選用不同花生品種遠雜9102、豐花2號和花814的胚小葉為外植體，通過分析不同激素配比、不同基因型誘導不定芽的差異，確定了適宜花生胚小葉不定芽誘導、繼代培養的最佳培養基，經伸長和生根培養，最終建立了花生胚小葉的離體再生體系。結果表明，6-BA和NAA組合誘導效果優于TDZ，最佳不定芽誘導培養基為M519+4.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，豐花2號、遠雜9102、花814均有較高的不定芽誘導率;最佳繼代培養基為M519+4.0mg/L6-BA，3個基因型品種的芽再生率較高，均超過64%;在1/2MS+0.2mg/LIBA+0.1mg/LNAA的生根培養基中，豐花2號、遠雜9102、花814的生根率依次為73.80%、60.32%、50.66%。本研究初步建立了不依賴于基因型的較廣適花生胚小葉再生體系。

關鍵詞：花生;胚小葉;不定芽誘導;離體再生體系

中圖分類號：S565.201 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2021）12-0017-08

花生（ArachishypogaeaL.）又名落花生，雙子葉植物，在世界范圍內廣泛種植，是重要的油料和經濟作物之一，具有適應性廣、經濟效益高等優點。我國是全球花生貿易四大出口國之一，花生在我國占有極其重要的地位[1]。目前，我國花生種植面積為油料作物的第二位，總產量居首位[2]。花生的產量和品質往往受到多種病蟲害的影響，選育抗病蟲新品種、改良品質對花生產業發展具有重要意義。近年來分子生物學技術飛速發展，利用該技術改良花生品質、提高抗病蟲能力的新型育種方式受到了廣大育種工作者的青睞。分子育種技術往往同組織培養和遺傳轉化過程緊密聯系，花生離體再生及遺傳轉化技術發展相對緩慢，在一定程度上限制了其分子育種技術的發展，建立高效、穩定、廣適的再生體系是促進花生分子育種研究的關鍵。

目前，關于花生組織培養的報道日益增多，其中以花生胚小葉為外植體的再生體系已有較多報道。何曄[3]、尤淑麗[4]等研究了不同花生品種的愈傷組織誘導率和不定芽分化率。張月婷等[5]建立了高效的花生再生體系，認為豐花2號有較強的再生能力。隋炯明等[6]比較了不同基因型的胚小葉不定芽誘導率，認為龍生型>珍珠豆型>多粒型。任艷等[7]比較了不同濃度NAA和TDZ對胚小葉的誘導情況。但仍然存在較多問題，如再生體系重復性差，再生過程基因型依賴性強等。因此，建立一個不依賴基因型的廣適性再生體系勢在必行。本研究選用不同花生品種的胚小葉為外植體，通過對不同激素配比的篩選試驗，確定了適宜花生胚小葉不定芽誘導、伸長和生根的最佳培養基，初步建立了適于不同基因型花生的離體再生體系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用花生品種為遠雜9102（珍珠豆型）、花814（普通型）、豐花2號（珍珠豆型），以其自然風干的種子為試材。

1.2 試驗方法

1.2.1 基礎培養基及培養條件 基礎培養基為M519和1/2MS，添加3%蔗糖和0.8%瓊脂，用NaOH調pH值至5.7～5.8。所有培養基均在121℃ 下高壓蒸汽滅菌15 min。培養條件：26/24℃，16h/8h光/暗循環，60%相對濕度。

1.2.2 種子預培養 分別取豐花2號、遠雜9102、花814莢果，去殼后挑選飽滿健康的種子進行消毒：將種子放入無菌罐頭瓶中，倒入75%乙醇消毒40s，棄乙醇，用無菌水沖洗幾次;加入0.1%氯化汞溶液浸泡10min，棄氯化汞溶液，用無菌蒸餾水清洗4～5次，最后加入無菌蒸餾水浸泡過夜。

1.2.3 外植體制備及不定芽誘導 將浸泡好的種子在無菌條件下取出完整胚，并從基部切下胚小葉，將胚小葉在一次性培養皿上用手術刀充分分散成單一胚小葉，使之不粘連，然后接種于含有不同配比6-BA和NAA或不同濃度TDZ的誘導培養基上，于光照培養箱培養40～50d后統計不定芽誘導率。

6-BA設置3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mg/L的濃度梯度，NAA設置0.2、0.5mg/L的濃度梯度，TDZ設置0.02、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mg/L的濃度梯度;6-BA和NAA配比的篩選以李拴柱[8]的4.5mg/L6-BA+1.4mg/LNAA為對照。每皿接種30個外植體，每種激素處理設置3次重復，每3皿為一個重復。

1.2.4 叢生芽誘導及再生成苗 誘導培養60d后，切下誘導出的不定芽，接種至繼代培養基誘導叢生芽，之后每30d繼代一次。繼代培養基設置3.0、4.0、5.0mg/L的6-BA濃度梯度。繼代時將仍有芽點的組織接種至相同的繼代培養基增殖，而將長度1cm左右的芽移至生根培養基1/2MS+0.2mg/LIBA+0.1mg/LNAA，使之伸長并生根。每處理繼代3～4次，每次均記錄叢生芽數及芽再生數，并進行生根培養，統計生根率。

1.3 數據統計與分析

采用MicrosoftExcel對數據進行處理與統計分析。根據下列公式計算各指標值。

不定芽誘導率（%）=誘導出不定芽的外植體數/接種外植體數×100 ;

叢生芽誘導率（%）=產生叢生芽的外植體數/接種外植體數×100 ;

芽再生率（%）=叢生芽上長度大于1cm的芽數/外植體數×100 ;

生根率（%）=生根芽數/再生芽數×100 。

2 結果與分析

2.1 不定芽誘導培養基的篩選

2.1.1 不同品種的不定芽誘導差異 將遠雜9102、豐花2號、花814的胚小葉置于含有4.5mg/L6-BA+1.4mg/LNAA的誘導培養基上培養，豐花2號培養3周左右分化出嫩綠的具有生命力的不定芽，且產生的不定芽多，培養至30d時產生的水漬狀愈傷少，不定芽仍然具有旺盛的生命力;而遠雜9102培養20d左右即分化出深綠色不定芽和松軟的水漬狀愈傷，培養至30d時水漬狀愈傷增多且有部分轉化成雪花狀，已經分化的不定芽也逐步向水漬狀愈傷轉化;花814培養過程中誘導不定芽的同時往往伴隨大量松散的愈傷，影響后期不定芽的伸長（圖1）。可見，3個品種胚小葉在相同環境下進行培養，均可誘導出不定芽，但不定芽形態存在差異，推測形態差異可能與內源激素含量不同有關。

2.1.2 6-BA與NAA不同配比對不定芽誘導的影響 由表1可見，豐花2號和遠雜9102的最適激素配比均為4.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，誘導率分別為75.60%和66.17%，其中，豐花2號顯著高于對照，而遠雜9102與對照無顯著差異。NAA濃度為0.5mg/L時，無論6-BA濃度多少，遠雜9102各組誘導率均與對照無顯著差異。花814的最適激素配比為4.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA，誘導率為66.30%，4.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA的誘導率略低，但兩者間差異不顯著，均與對照組無顯著差異;NAA濃度為0.5mg/L時，各種配比的不定芽誘導率也均與對照差異不顯著。3個品種間比較，在最適6-BA和NAA配比下，豐花2號的不定芽誘導率明顯高于遠雜9102和花814;而在對照組6-BA和NAA配比下，遠雜9102和花814的不定芽誘導率要高于豐花2號。

以豐花2號為例，將其胚小葉接種至6-BA和NAA不同濃度配比的培養基上，一周后胚小葉逐步變綠，3周后葉柄基部或傷口處開始膨大并出現綠色芽點。隨著培養時間的延長，芽點逐步發育成不定芽，30d時不定芽清晰可見（圖2A）;但繼續培養，會出現水漬狀和白色蓬松狀愈傷，不定芽誘導率逐步降低，因此選擇每30d繼代一次。

2.1.3 不同濃度TDZ對不定芽誘導的影響 由表2可見，豐花2號在5.00mg/LTDZ處理時有最高不定芽誘導率，但與3.00、4.00mg/LTDZ處理差異不顯著。遠雜9102在1.00mg/LTDZ處理時不定芽誘導率顯著高于0.02mg/LTDZ處理，繼續提高TDZ濃度可提高不定芽誘導率，但未達顯著水平。花814在3.00mg/LTDZ處理時不定芽誘導率顯著高于CK，繼續提高TDZ濃度可提高不定芽誘導率，但差異不顯著。

以豐花2號為例，將其胚小葉接種至不同濃度TDZ誘導培養基上，胚小葉前期迅速膨大變綠，培養20d左右時逐步在小葉背面基部出現芽點，培養30d時仍較小（圖2B），整個培養過程中幾乎沒有出現水漬狀或雪花狀愈傷;但隨著TDZ濃度升高，產生的不定芽越來越難以分化出叢生芽，在伸長培養基上逐步轉化為水漬狀愈傷。

綜合來看，6-BA和NAA配合使用對3個花生品種不定芽的誘導效果優于單獨使用TDZ;其中豐花2號更易被激素誘導，而遠雜9102和花814誘導效果更為穩定。

2.2 繼代培養基及繼代次數的篩選

3個品種在含不同濃度6-BA的繼代培養基上均可實現芽再生，但叢生芽誘導率和芽再生率存在差異。其中豐花2號、遠雜9102均在添加4.0mg/L6-BA的培養基上有最高叢生芽誘導率（分別為56.69%、36.36%）和芽再生率（分別為267.54%、72.73%），花814在添加5.0mg/L6-BA 的培養基上有最高叢生芽誘導率（27.78%），但在該濃度下芽再生率小于添加4.0mg/L6-BA的繼代培養基（表3）。此外，無論是含3.0mg/L還是4.0mg/L6-BA的培養基，叢生芽誘導率基本一致，但芽再生率均為含4.0mg/L6-BA的培養基最佳。這表明3個品種對外源激素的敏感性不同，可能受自身內源激素的影響。綜上所述，含4.0mg/L6-BA的繼代培養基對3個品種的芽再生效果更好，具有廣適性。

繼代過程中發現隨著繼代次數的增多，繼代誘導的叢生芽比例逐步增多。3個品種均存在這種現象。以豐花2號在含有4.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA培養基上誘導的不定芽的繼代情況為例（圖3和圖4），第一次繼代叢生芽誘導率僅為20.25%，平均芽再生數約為1.70個;第二次繼代后叢生芽誘導率大幅提升至90.11%，平均芽再生數約為2.41個;第三次繼代后，叢生芽誘導率達到最大值94.37%，平均芽再生數略有降低，約為1.86個;直至繼代4次后，叢生芽誘導率依然大于90%，而平均芽再生數增加至最大值4.11個。由此可見，繼代對不定芽再生有著重要影響，可通過適當提高繼代次數來為更多具有潛在再生能力的不定芽提供充足養分，從而獲得更多再生植株。

2.3 不同品種生根培養差異

再生芽轉入生根培養基中，兩個月后產生粗壯根系，繼續培養可在瓶中開花下針（圖5）。在添加0.2mg/LIBA+0.1mg/LNAA的生根培養基中，豐花2號、遠雜9102、花814的生根率分別為73.80%、60.32%、50.66%（表4）。

2.4 花生胚小葉再生體系的建立

綜合上述試驗結果，建立了比較廣適的花生胚小葉再生體系：挑選飽滿健康的花生種子，消毒并浸泡過夜后在無菌條件下取出完整胚，從基部切下胚小葉，充分分散后作為外植體接種于M519+4.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA進行誘導培養，不定芽誘導過程約需30d;叢生芽誘導及芽再生過程需及時繼代，繼代培養基為M519+4.0mg/L6-BA，誘導培養60d時第一次繼代，后每30d繼代一次，以使更多的不定芽伸長、叢生芽生長更為旺盛，本試驗共繼代3～4次;生根過程需持續兩個月，生根培養基為1/2MS+0.2mg/LIBA +0.1mg/LNAA，第一個月時再生芽即可誘導出根，繼續培養根系逐漸粗壯，側根增多，植株生長發育更為健壯，部分植株甚至可在培養瓶中開花下針;將健壯植株移栽至花盆中，在32℃/25℃、16h/8h光/暗循環、60%相對濕度的室內培養，最終收獲莢果（圖6）。整個再生周期約為8個月。

3 討論與結論

前人的研究表明基因型依賴性是限制花生離體培養和遺傳轉化的重要因素[9]。為解決這一問題，本試驗以花生胚小葉為外植體，對豐花2號、遠雜9102、花814進行再生培養，旨在通過改變激素比例，使之忽略基因型依賴性，從而建立較為廣適的再生體系，實現花生離體再生。

不同品種由于內源激素含量不同，外植體離體再生所需的培養條件也不盡相同。本試驗用到的3個品種在相同的培養條件（M519+4.5mg/L6-BA+1.4mg/LNAA）下誘導的不定芽形態存在較大差異且生長速度也不同，這表明3個品種內源激素含量存在差異，為建立廣適性的再生體系提供了前提。

前人研究已確定花生胚小葉誘導不定芽的激素及濃度范圍為6-BA3～6mg/L、NAA1mg/L左右[10-12]，不定芽分化則多使用3～5mg/L6-BA[13-15]。本試驗所設6-BA和NAA濃度均在此范圍內，結果發現6-BA濃度對不定芽誘導的影響較NAA更大，這印證了適宜的6-BA和NAA濃度配比對不定芽誘導和分化起著重要作用[16]。此外，我們還發現6-BA和NAA組合誘導效果優于單獨使用TDZ，這表明多激素組合使用再生效果更好，側面反映花生的生長發育是多激素協調合作的結果[17]。

此外，繼代培養過程中我們發現多次繼代可使更多具有潛在再生能力的不定芽形成叢生芽，從而提高芽再生率，繼代4次后叢生芽誘導率仍大于90%，平均芽再生數為4.11個。這表明在不定芽誘導率較低的情況下，可以通過多次繼代獲得較多再生苗，這也為后期提高遺傳轉化效率提供了一定參考。

本研究建立了以胚小葉為外植體的較廣適的花生高效再生體系，適宜不定芽誘導的最佳培養基為M519+4.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，不定芽誘導率均大于50%，最佳繼代培養基為M519+4.0mg/L6-BA，芽再生率均大于64%，其中豐花2號高達267.54%，繼代4次的叢生芽誘導率仍高于90%;在1/2MS+0.2mg/LIBA+0.1mg/LNAA的生根培養基中，生根率均大于50%。這為下一步進行花生遺傳轉化研究奠定了基礎。