根際促生菌與生物炭制劑對辣椒生長發育及土壤改良效果的影響

蘇彩霞 董旭

摘要：本試驗將2個熱解溫度（400℃、600℃）生產的生物炭成品與枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）B38制備為根際植物促生菌（PGPR）-生物炭制劑，并以此為材料設置5個處理，采用溫室盆栽試驗法，研究PGPR-生物炭制劑對辣椒生長發育和土壤養分的影響。結果表明，生物炭、PGPR（B.subtilisB38）皆可有效地促進辣椒種子萌發，且基于平板計數數據顯示，生物炭可提高B.subtilisB38菌株在土壤中的存活數。與空白對照（CK）相比，單施B.subtilisB38（Bs）、單施生物炭處理（BC400、BC600）皆可在一定程度上促進辣椒植株鮮重、干重、株高、莖粗、葉面積、葉綠素含量的增加，改善葉綠素熒光參數、土壤質地及土壤肥力水平，但效果不顯著;PGPR-生物炭處理（Bs+BC400、Bs+BC600）中上述指標得到顯著提升，且Bs+BC400處理整體優于Bs+BC600處理。基于土壤理化性質與植株生長發育指標進行相關分析表明，除pH和CEC值外，土壤容重、土壤持水量、有機質及速效氮磷鉀等指標與生長指標均存在顯著或極顯著相關關系。綜上，400℃條件下制備的生物炭與B.subtilis38聯合施用（Bs+BC400）是最優處理，其可通過改良土壤質地、提升土壤肥力而促進辣椒的生長發育。本研究結果可為土壤改良和新型肥料的開發提供理論依據。

關鍵詞：生物炭;枯草芽孢桿菌;PGPR-生物炭制劑;辣椒;生長發育;熒光參數;土壤改良

中圖分類號：S641.301 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2021）12-0109-09

施用化肥是補充土壤養分的重要措施，化肥在促進作物生長發育、提高作物產量中發揮了巨大作用，但肥料利用率低造成的土壤質量退化、養分流失、微生物數量減少等一系列負面影響已成為農業生產面臨的主要難題[1]，可持續化生產已然成為未來農業發展的必然趨勢。植物根際促生菌（PGPR）是一類有益微生物。大量研究表明PGPR能夠通過產生次生代謝物、生長激素和鐵載體[2]促進植物養分吸收，緩解植物應對重金屬脅迫，保護植物免受土壤病原菌侵害，并可提高土壤養分生物轉化率等，因此廣泛用于土壤改良、化肥減效以及生物防治等領域[3]。實際運用過程中，PGPR的載體性能是保證菌株田間效果的關鍵，良好的載體材料應提供保護棲息地、提高接種效率和免受土壤動物取食[4]。目前通常使用的載體是煤、泥炭、植物廢料（如玉米棒、堆肥基質）和惰性材料（如蛭石、珍珠巖），但其載體性能仍不理想[5]。

生物炭是農林廢棄物、畜禽糞便和污泥等生物質材料在限氧或無氧條件下，經低-中溫熱裂解得到的一種富碳產品[6，7]。在農業生產中，生物炭常用作土壤改良劑。目前研究表明生物炭具備有效降低土壤容重（BD）、增加持水性能（WHC）、提高土壤陽離子交換量（CEC）以及吸附污染物等功能[8]。此外，生物炭較大的孔隙結構和有效的底物養分，可為微生物提供適宜的生態位，即可提高微生物的增殖并降低被捕食風險[9]。Hale等[10]發現將PGPR菌株EnterobactercloacaeUW5接種到松木制備的生物炭中，可有效促進黃瓜植株的生長發育，增加WHC、降低土壤BD。Wang等[11]采用玉米秸稈和豬糞制成的生物炭載Bacillussubtilis可有效吸附土壤重金屬物質，促進植株生長。Tripti等[12]采用污泥生物炭載PGPR菌株BurkholderiaphytofirmansPsJN可提高土壤過氧化氫酶、磷酸酶活性，促進番茄植株生長發育進而增加果實產量。

上述研究為生物炭作為PGPR的載體提供了一定的理論依據，展現出PGPR-生物炭協同增效的農業應用前景。然而不同PGPR菌株對載體的適應性不同，不同溫度熱解制備的生物炭性能也可能存在差異。基于此，本試驗探索枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis） B38對不同熱解溫度（400℃、600℃）生物炭載體的適宜性，并研究該PGPR-生物炭制劑對辣椒生長發育及土壤的改良效果，以期為今后PGPR與生物炭廣泛應用于農業可持續發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2020年5—9月于內蒙古自治區農牧業科學院日光溫室中進行。溫室內溫度（25±3）℃，相對濕度50% ～70%。供試辣椒品種為迅馳37-74，來自該院蔬菜研究所。

PGPR菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）B38，來自南開大學Sulab實驗室，且已證實該菌株可有效存活于優良生物炭載體材料中，平板對峙試驗表明該菌株是潛在的生防菌株[11]。生物炭為辣椒秸稈、棉花秸稈按質量為1∶1比例分別在400℃和600℃熱解制備而成，由Sulab實驗室生產。生物炭理化性質及其具體制備工藝參見文獻[11]。

PGPR-生物炭制劑的制備：將B.subtilisB38菌落轉移到100mL的Pikovskaya培養基上平板劃線培養，之后接種到含有無菌牛肉膏蛋白胨液體的250mL錐形燒瓶中，（26±2）℃條件下在150r/min的搖床上振蕩培養24h。培養結束將含有1010 cfu/mL的懸濁液用作制備生物制劑的接種劑。將20mL懸濁液加入到含有聚乙烯袋的1kg無菌生物炭中，含水率保持40%，菌液與生物炭手工混合，留70%左右的空隙進行包裝，為PGPR-生物炭制劑提供足夠的通氣，保存于26℃干燥環境處。

供試土壤取自興安職業技術學院試驗田內0～20cm表層，質地為沙壤。其理化性質：pH值8.25，有機質12.26g/kg、全氮0.98g/kg、堿解氮55.61mg/kg、有效磷60.13mg/kg、速效鉀120.52mg/kg。土樣經風干混勻后過3mm網篩，采用硝基三氯甲烷（CCl3NO2）對土壤進行化學熏蒸后待用。

1.2 試驗設計及方法

采用盆栽試驗法共設置6個處理，分別為不施生物炭、不添加PGPR的空白處理（CK）;僅添加B.subtilisB38的PGPR菌株處理（Bs）;僅施用400℃制備的成品生物炭處理（BC400）;僅施用600℃制備的成品生物炭處理（BC600）;添加B.subtilisB38和400℃制備的成品生物炭制劑處理（Bs+BC400）;添加B.subtilisB38和600℃制備的成品生物炭制劑處理（Bs+BC600）。每處理重復5次。

各處理均按當地常規施肥加入氮、磷、鉀肥（N∶P2O5∶K2O=4∶2∶1），即分別施尿素、氯化鉀和過磷酸鈣，純氮施用量為每盆4.80g。Bs處理加入B.subtilisB38懸濁液體積同PGPR-生物炭制劑所用體積;同理，BC400、BC600處理所用生物炭同制備PGPR-生物炭制劑用量。除Bs處理外，生物炭各處理添加量為盆栽用土量的2%，每盆裝土5kg。

盆栽裝置為塑料桶，高28cm、上口徑44cm、底徑28cm。化肥、PGPR懸濁液、生物炭以及PGPR-生物炭制劑均與土壤混勻后裝盆。每盆做好標記，按60cm×60cm隨機擺放。采用2%NaClO對辣椒種子進行表面消毒10min，再用95%乙醇進行消毒，采用流動的無菌水沖洗數次后，每盆精選10粒播種。定期澆水且保持WHC為70%，待種子完全萌發10d后，選擇3株生長良好且長勢均一的植株定植。試驗其它管理措施同當地辣椒生產規程。共培養100d。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 辣椒種植期PGPR存活數及種子發芽率

為了評估生物制劑的田間菌株存活數，每20d檢查PGPR菌株處理的B.subtilisB38土壤濃度（采用土壤稀釋-平板稀釋計數法計算B.subtilisB38數量），共檢測5次。

種子發芽率測定[13]：播種后4～10d，每天早上記錄種子發芽數。種子發芽率（%）=發芽種子數/種子總數×100。

1.3.2 辣椒植株生物量及農藝性狀 培養100d后，小心取出各處理整株辣椒，采用全自動電子秤稱其鮮重，之后將地上部、根系分開，105℃殺青30min，75℃烘干至恒重并稱重。每盆辣椒3株，因此生物量為3株的總和。農藝性狀包括株高、莖粗、葉面積等，測量方法同常規農作物農藝性狀測量。重復3次取平均值。

1.3.3 葉綠素含量及葉綠素熒光參數 培養100d后，辣椒葉片葉綠素含量采用丙酮侵染-分光光度計法測定[14]。

選定晴天上午（10∶30）采用HF-3010手持式葉綠素熒光儀測量葉片熒光參數[15]。經過25min暗處理，測定植株生長點以下第3片完全展開葉的初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）及正常光照下的初始熒光（Fo′）、最大熒光（Fm′）及穩態熒光（Fs），各處理重復3次。葉綠素熒光參數中，PSⅡ的最大光化學效率Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm，實際光化學效率ΦPSⅡ =（Fm′-Fs）/Fm′，光化學熒光猝滅系數qP=（Fm′-Fs）/（Fm′-Fo′），非光化學熒光猝滅系數NPQ=（Fm-Fm′）/Fm。

1.3.4 土壤理化性質 培養100d后，對盆栽土壤進行破壞性取樣。土壤指標的測定按照鮑士旦的方法[16]進行。土壤pH值采用電位法測定，土壤容重采用環刀法測定，土壤持水量采用酒精灼燒法測定;土壤有機質采用重鉻酸鉀容量法測定，有效磷采用0.5mol/LNaHCO3浸提法測定，速效氮采用堿解氮擴散法測定，速效鉀采用NH4OAc浸提-火焰光度計法測定，土壤陽離子交換量采用乙酸銨交換法測定。

1.4 數據處理與分析

試驗數據采用MicrosoftExcel2013系統進行整理，SPSS19.0軟件進行統計分析，Origin9.1軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 PGPR-生物炭制劑菌株存活效率及對種子萌發的影響

由圖1A看出，PGPR處理（Bs、Bs+BC400、Bs+BC600）的B.subtilisB38濃度隨著培養時間延長呈逐漸降低趨勢。培養20d時，各處理差異較小，之后B.subtilisB38濃度迅速下降，其中Bs處理下降趨勢最為明顯;培養60d時，Bs+BC400與Bs+BC600處理趨于平緩，而Bs處理仍呈下降趨勢;培養80～100d時各處理B.subtilisB38濃度均趨于平緩，其中以Bs+BC600處理最高，其次為Bs+BC400處理，Bs處理最低。

圖1B顯示，播種后第4d，Bs處理辣椒種子發芽率最高，CK最低，僅為40%，明顯低于其它處理。之后各處理種子發芽率皆呈上升趨勢，以CK表現尤為明顯，其它處理上升趨勢較為平緩，但對照始終低于其它處理。第10d種子發芽基本結束，Bs+BC600、Bs+BC400、BC600、BC400、Bs、CK處理的發芽率分別為96.00%、94.54%、90.17%、88.00%、85.27%、82.11%。

2.2 PGPR-生物炭制劑對辣椒生物量累積的影響

由圖2A 看出，辣椒地上部鮮重以Bs+BC400處理最高，其次為Bs+BC600處理，兩者無顯著差異，但均顯著高于其它處理。生物炭各處理（BC400、BC600、Bs+BC400、Bs+BC600）較CK增加53.36% ～67.31%。根系鮮重仍以Bs+BC400處理最高，其次為Bs+BC600處理，BC400、BC600處理略低，四者無顯著差異，但均顯著高于CK。整體來看，BC400、BC600、Bs+BC400、Bs+BC600較CK分別增加34.19%、35.26%、60.80%、52.22%。CK最低，Bs其次，兩者間無顯著差異。

由圖2B看出，地上部干重以Bs+BC400處理最多，達72.33g/盆，其次為Bs+BC600處理，為67.8g/盆，兩者無顯著差異，其中Bs+BC400處理顯著高于其它4個處理，Bs+BC600僅顯著高于CK、Bs兩處理。根系干重仍以Bs+BC400處理最大，與Bs+BC600處理差異不顯著，但顯著高于其它處理，CK最低，與其它處理差異顯著，Bs、BC400、BC600處理間無顯著差異。

2.3 PGPR-生物炭制劑對辣椒農藝性狀及葉綠素含量的影響

由表1可以看出，辣椒株高以Bs+BC400處理最高，其次為Bs+BC600處理，兩者間無顯著差異，分別較CK顯著提高40.01%、31.40%，CK、Bs處理較低，兩者間無顯著差異，但皆顯著低于其它處理。葉面積表現為CK與Bs處理、BC400與BC600處理、Bs+BC400與Bs+BC600處理，兩兩處理間無顯著差異，其中PGPR-生物炭處理（Bs+BC400、Bs+BC600）葉面積較大，顯著大于其它處理。辣椒莖粗以Bs+BC400最高，但各處理間均無顯著差異。

PGPR-生物炭處理（Bs+BC400、Bs+BC600）葉綠素a含量較高，顯著高于CK與Bs處理，但與單施生物炭處理（BC400、BC600）差異不顯著。葉綠素b以Bs+BC400、Bs+BC600處理含量最高，皆為0.99mg/g，較其它處理顯著增加0.22～0.14mg/g，CK最少，但與Bs、BC400、BC600處理差異不顯著。葉綠素總量仍以Bs+BC400、Bs+BC600處理含量較高，顯著高于其余處理，其次為BC400、BC600、Bs處理，其中BC400處理顯著高于CK。

2.4 PGPR-生物炭制劑對辣椒熒光參數的影響

PSⅡ最大光化學量子效率（Fv/Fm）反映PSⅡ反應中心光能的最大轉換效率或PSⅡ原初光能轉換效率[17]。由圖3A可知，PSⅡ最大光化學效率以Bs+BC400處理最大，較其它處理增加1.15% ～14.29%，與Bs+BC600處理無顯著差異，而顯著高于其它處理。Bs+BC600、Bs、BC400、BC600處理間均無顯著差異。

PSⅡ實際光化學量子效率（ΦPSⅡ）反映PSⅡ反應中心部分關閉情況下實際原初光能的捕獲效率。由圖3B可知，ΦPSⅡ以Bs+BC400、Bs+BC600處理較高，二者較其它處理分別顯著提高16.39% ～29.09%、11.48% ～23.64%，BC400與BC600處理間無顯著差異，CK、Bs處理顯著低于其它處理。

光化學熒光猝滅系數（qP）表示天線色素吸收的光能用于光化學電子傳遞的比值，反映PSⅡ反應中心的開放與獲取程度。由圖3C可知，qP以Bs+BC400處理最高，Bs+BC600處理略低，二者無顯著差異，較其它處理分別增加12.63% ～24.42%、7.37% ～13.95%。CK最小，與BC400處理差異顯著。

非光化學猝滅系數（NPQ）反映PSⅡ反應中心吸收的光能無法用于光合電子傳遞，而以熱能形式損失掉的光能部分。由圖3D可知，NPQ以CK最高，Bs+BC400處理最低，較其它處理低23.26% ～45.90%，與Bs+BC600處理差異不顯著。

2.5 PGPR-生物炭制劑對土壤理化性質的影響

由表2看出，添加生物炭處理后（BC400、BC600、Bs+BC400、Bs+BC600）土壤容重均不同程度降低，分別比CK 降低6.85%、8.22%、10.27%和10.96%;土壤持水量則顯著增加，以Bs+BC400處理最高，較CK增加17.79%。添加B.subtilisB38菌株土壤pH值均顯著下降，這可能歸因于微生物活動和代謝產生的腐植酸使得土壤微域pH值下調。由于生物炭本身含有一定的有機質，因此添加生物炭處理后顯著增加土壤有機質含量。

土壤陽離子交換量是表征土壤改良效果的重要參數。與CK相比，生物炭處理土壤的CEC值顯著增加7.60% ～12.61%，而單施PGPR處理（Bs）的土壤CEC值下降5.43%，但與CK無顯著差異。

施入生物炭和PGPR處理皆增加土壤速效養分含量（表2）。與CK相比，各處理土壤速效氮含量增幅為1.72% ～22.96%，其中Bs處理與CK差異不顯著，而添加生物炭各處理均與CK差異顯著;速效鉀含量以Bs+BC400處理最高，較CK及Bs處理顯著增加19.19%、9.83%，與其它生物炭處理差異不顯著;各處理有效磷含量表現為CK

2.6 土壤理化性質指標與辣椒生長相關指標的相關性分析

對土壤理化性質指標與辣椒植株生長相關指標進行相關性分析，結果（表3）表明，pH、CEC值與植株生長相關指標皆分別呈負、正相關（除NPQ外），但未達統計學差異水平;土壤持水量與光化學猝滅系數（qP）呈正相關但未達顯著水平，而與其余生長指標皆呈顯著正相關;容重與辣椒生長各指標呈顯著或極顯著負相關，與之相反，有機質、速效氮、有效磷、速效鉀與植株生長指標呈顯著或極顯著正相關。綜上，施入PGPR-生物炭制劑導致的土壤容重降低、持水量提升、有機質升高與土壤有效養分含量的增加是促進辣椒生長發育的主要因素。

3 討論與結論

根際促生菌（PGPR）是植物根系重要的功能性微生物菌群，可通過養分活化、產生胞外多糖及激素分泌等方式促進植物生長發育，現已成為發展可持續化農業生產的重要資源[5，18]。為了保證PGPR菌株的功能活性，各種載體材料被廣泛應用，為PGPR應用于田間生產提供了強有力的保障[19]。本研究表明，在B.subtilisB38施入土壤后，該菌株在土壤中的濃度隨著辣椒植株生育期的推進而呈下降趨勢，Bs處理降幅最為明顯，而基于生物炭載B.subtilisB38的PGPR-生物炭處理中，菌株數量下降較為平緩，各處理在培養80d后趨于穩定，此時Bs處理的菌株數量明顯低于PGPR-生物炭處理，其中Bs+BC600處理的菌株濃度大于Bs+BC400處理，表明生物炭材料具備PGPR優良載體的基本特征，且600℃制備的生物炭對B.subtilisB38的保護效果更佳。在連續7d的種子發芽率試驗中，單接種PGPR處理（Bs）、單施生物炭（BC400、BC600）、生物炭-PGPR處理（Bs+BC400、Bs+BC600）皆高于CK，且最終以生物炭各處理發芽率較高，尤其是Bs+BC400、Bs+BC600處理。結合PGPR在土壤中的濃度數據，推斷這一結果可能歸因于生物炭多孔隙結構和自身具備的養分底物有效性[20]，使得B.subtilisB38更好地發揮作用，從而在一定程度上保證了種子萌發的良好環境。

本研究表明，辣椒地上部、根系鮮重及干重，各處理均表現為CK

葉綠素是植物體內參與光合作用的主要色素，葉綠素含量是表征植物光合能力和健康狀況的重要指標[22]。本研究中，生物炭各處理的葉綠素各組分含量均高于單施PGPR處理（Bs）和CK。而Bs處理葉綠素a、b和葉綠素a+b較CK略有增加但無顯著差異。這可能是PGPR可以刺激內源信號分泌從而提高葉片光合色素的產生[23]。植物的絕大多數生物量和經濟產量來源于光合作用產生的碳水化合物，葉綠素熒光參數是體現光合作用速率及其生產力的重要表征[1]，其變化取決于植物自身的生物學特性，同時也受外界環境因素所影響[15，17]。本研究發現，施用生物炭或PGPR，其PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）和實際光化學效率（ΦPSⅡ）以及光化學猝滅系數（qP）均得到一定增長，非光化學猝滅系數（NPQ）下降，說明生物炭和PGPR可有效促進葉片葉綠素的光合反應，其中以Bs+BC400、Bs+BC600處理較佳，且前者整體大于后者，表明400℃制備的生物炭配施PGPR可有效促進光合作用。

本研究中，PGPR、生物炭的添加提高了種植后土壤有機質及速效氮磷鉀含量、土壤持水量、陽離子交換量（CEC），降低了土壤容重和pH值，兩者合施效果更佳，表明PGPR-生物炭制劑可進一步提升土壤肥力、改善土壤質地，且使土壤pH更偏于中性。Gorovtsov等[24]研究表明，PGPR菌株具有養分活化功能，生物炭載PGPR的生物制劑可更一步改善土壤理化性質，這與本研究結論基本一致。本研究中，與CK相比，添加PGPR各處理雖在一定程度上提高了磷的有效性，但皆未達顯著水平，這可能是供試土壤本身速效磷含量較高而掩蓋了B.subtilisB38的溶磷效果[25]。此外，對土壤指標和植株生長指標的相關性分析表明，除pH和CEC值外，土壤孔隙度、持水量、有機質及速效氮磷鉀等指標皆整體與辣椒植株生長指標存在顯著或極顯著的相關關系。表明PGPR、生物炭可通過改良土壤質地、提升土壤肥力而促進辣椒生長發育。

綜上，生物炭、B.subtilisB38能有效地促進種子萌發，且生物炭可提高土壤菌株的存活數。單施B.subtilisB38及單施生物炭皆可在一定程度上促進辣椒植株的生長發育、改善土壤理化性質，但效果不明顯，PGPR-生物炭聯合施用整體顯著提高了植物生物量累積、農藝性狀、葉綠素含量，改善了葉綠素熒光參數、土壤質地及土壤肥力水平，且在上述指標中，Bs+BC400處理整體優于Bs+BC600處理，表明400℃條件下制備的生物炭載B.subtilisB38對辣椒生長發育及土壤改良效果最優。