MAPK/ERK通過誘導纖維蛋白A磷酸化抑制垂體瘤細胞增殖、凋亡、遷移及相關信號轉導

楊延慶，王煥煥*，謝坤霞，李 健

0 引言

垂體瘤是存在于腦垂體中的一種腫瘤，大多數是良性腫瘤，部分會發展成惡性腫瘤[1]。目前，對于垂體瘤的治療方法，主要包括手術治療、藥物治療和放射治療，手術治療會引起一系列的后遺癥和并發癥，藥物治療具有一定的局限性，放射治療對垂體的功能有很大的損傷性[2]。MAPK/ERK通路是多種信號通路的核心，此通路在細胞增殖、細胞凋亡的過程中發揮著重要作用，同時在腫瘤的發生發展中也發揮著重要的作用，已經被作為抗炎、抗癌藥物的靶點[3-6]。目前，MAPK/ERK通路在垂體瘤細胞的發生過程中的作用尚未闡明。有報道，纖維蛋白在腫瘤細胞向周圍組織浸潤以及向遠端組織轉移的過程中發揮重要作用[7]。吳丹榮等[8]研究發現，在垂體瘤的增殖和遷移中，其作用機制與NF-κB通路的活化有關。

本研究通過SB203580(MAPK/ERK抑制劑)處理垂體瘤細胞后，檢測SB203580在垂體瘤細胞纖維蛋白A以及垂體瘤細胞增殖、凋亡、遷移以及NF-κB/MMP-9/VEGF通路中的影響，以期為研究治療垂體瘤的方法提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM培養基、胎牛血清購自美國HyClone公司；Trizol、氯仿購自Takara公司；FastKing RT kit購自北京天根生化公司；0.25%胰酶溶液、PBS溶液、結晶紫溶液、細胞固定液、RIPA強蛋白裂解液購自北京索萊寶生物科技有限公司；CCK-8試劑盒、MAPK/ERK抑制劑(SB203580)、Annexin V-PE細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天有限公司；CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax、細胞纖維蛋白A磷酸化、NF-κB、MMP-9、VEGF、β-actin和山羊抗鼠二抗購自美國Cell Signaling Technology；Transwell小室購自美國Millpore公司；梯度PCR儀、核酸電泳儀、紫外凝膠成像系統購自Bio-Rad公司；細胞培養箱購自Thermo公司；倒置熒光顯微鏡購自Nikon公司。

1.2 細胞培養 人的垂體瘤細胞株購自北京細胞庫(AtT20細胞株)，取出冷凍的細胞，在37 ℃的水浴鍋內快速解凍，爭取在1 min內完成，離心3 min(1 000 r/min)，在超凈臺內棄掉細胞上清，用含有血清濃度為10%的DMEM培養基重懸細胞沉淀至25 cm2的細胞培養瓶中，在37 ℃、5% CO2的條件下于培養箱中培養。

1.3 SB203580最佳安全濃度的確定 待垂體瘤細胞長滿，用0.25%胰酶溶液消化后，將其接種至96孔細胞培養板中，待垂體瘤細胞密度達到70%～80%，分別加入濃度為10 mmol/L的SB203580，使其最終濃度變成5、15、20、30、40、55、65、80、100、120、140 μmol/L (每個濃度設置3個復孔，同時設置空白對照)，細胞在37 ℃、5% CO2的條件下培養48 h后，加入合適劑量的CCK-8溶液，在培養箱孵育2 h后，在酶標儀中于450 nm波長處測定OD值，進行分析。

1.4 細胞增殖率的檢測 確定SB203580最佳安全濃度后，將垂體瘤細胞接種至96孔細胞培養板中，待垂體瘤細胞密度達到70%～80%，加入SB203580，培養48 h后，加入合適劑量的CCK-8溶液，設置空白細胞作對照，在培養箱孵育2 h后，在酶標儀中于450 nm波長處測定OD值，分析細胞的增殖情況。

1.5 流式細胞術檢測垂體瘤細胞的凋亡 待垂體瘤細胞密度達到70%～80%，加入SB203580，設置空白細胞作對照，在37 ℃、5% CO2的條件下培養48 h后，棄掉上清，0.25%胰酶溶液消化細胞后用PBS收集細胞懸液，800 r/min離心3 min棄掉上清，用預冷的PBS洗滌細胞2次，重新收集細胞沉淀，加入適量的1×Binding buffer將細胞數目調至1×106個/ml，取上述適量的細胞懸液(包含細胞數目為1×105個/ml)，加入200 μl Annexin V-PE結合液輕輕重懸細胞，混勻后避光孵育20 min，置于冰浴中，最后進行流式細胞儀檢測。

1.6 RT-PCR檢測CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax mRNA的表達 待垂體瘤細胞密度達到70%～80%，加入SB203580，設置空白細胞作對照，在37 ℃、5% CO2的條件下培養48 h后，棄掉上清，0.25%胰酶消化細胞后收集細胞沉淀，加入Trizol裂解細胞沉淀，提取細胞的總RNA，用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄得到cDNA，以此為模板，β-actin作內參，通過RT-PCR檢測不同樣品中CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax mRNA的表達情況。反應體系包括cDNA 0.4 μl，2×Fast qPCR Master Mixture(Green) 10 μl，上下游引物各0.4 μl，ddH2O 3.8 μl。反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，進行40個循環。擴增結果采用2-△△Ct法計算。引物序列見表1。

表1 RT-PCR的定量引物

1.7 Western blot檢測CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax、纖維蛋白A的磷酸化水平以及NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白的表達 待垂體瘤細胞密度達到70%～80%，加入SB203580，設置空白細胞作對照，在37 ℃、5% CO2的條件下培養48 h后，棄掉上清，收集細胞沉淀，加入RIPA裂解液(含有PMSF)裂解細胞蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作步驟根據說明書進行。在蛋白樣品中加入5×loading buffer于沸水中煮沸10 min后，取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后進行轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，將CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax、caspase3、纖維蛋白A的磷酸化、NF-κB、MMP-9、VEGF的抗體(1∶2 000)作為一抗進行過夜4 ℃孵育，用TBST洗膜5 min，洗3次后，用HRP標記的山羊抗鼠二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，用TBST洗膜5 min，洗3次后，加入ECL顯色液，于凝膠成像儀中曝光拍照。

1.8 細胞遷移能力檢測 待垂體瘤細胞密度達到70%～80%，加入SB203580，設置空白細胞作對照，在37 ℃、5% CO2的條件下培養48 h后，棄掉上清，收集不同處理的細胞沉淀，用空的DMEM培養基重懸細胞沉淀，使其細胞數目變成1×103個/ml，向包含基質膠的TranswellTM上室中接種100 μl左右的細胞懸液，上下室中加入1 ml含有血清濃度為10%的DMEM培養基，在37 ℃、5% CO2的條件下培養24 h后，取出Transwell，甲醛固定20 min后，用結晶紫染色20 min后，PBS洗滌3次，最后于顯微鏡下進行拍照和計數。

2 結果

2.1 SB203580最佳安全濃度的確定及SB203580抑制垂體瘤細胞中纖維蛋白A的磷酸化 CCK-8法確定SB203580的最佳安全濃度。結果顯示，當SB203580濃度為55 μmol/L時，細胞的活性和空細胞的活性接近，最后確定SB203580的使用濃度為55 μmol/L(圖1A)。通過Western blot實驗檢測SB203580處理垂體瘤細胞后，纖維蛋白A的磷酸化水平，結果顯示，SB203580組和空白組相比較，纖維蛋白A的磷酸化水平顯著下降(圖1B)，表明MAPK/ERK能夠誘導垂體瘤細胞的纖維蛋白A的磷酸化。

圖1 SB203580對纖維蛋白A磷酸化水平的影響注：A.CCK-8法檢測SB203580的最佳濃度；B.Western blot檢測SB203580組細胞中纖維蛋白A磷酸化的表達水平

2.2 SB203580促進垂體瘤細胞的增殖 CCK-8法檢測垂體瘤細胞的增殖情況。結果顯示，SB203580組細胞增殖情況顯著高于空白組(P<0.01)，見圖1。RT-PCR和Western blot實驗結果顯示，SB203580組垂體瘤細胞中CyclinD1、CyclinE1 mRNA和蛋白的表達量顯著高于空白組(P<0.01)，p21 mRNA和蛋白的表達量顯著低于空白組(P<0.01)。見圖2。

圖2 SB203580對垂體瘤細胞增殖的影響注：A.CCK-8法檢測SB203580對垂體瘤細胞增殖的影響；B.RT-PCR檢測CyclinD1、CyclinE1、p21 mRNA相對表達量；C.Western blot檢測CyclinD1、CyclinE1、p21蛋白表達。***與空白組比較，P<0.01

2.3 SB203580促進垂體瘤細胞的凋亡 SB203580處理細胞后，首先通過流式細胞術檢測垂體瘤細胞的凋亡百分數，結果顯示，SB203580組細胞凋亡百分數顯著高于空白組(P<0.01)。RT-PCR和Western blot實驗結果顯示，SB203580組垂體瘤細胞中Bcl-2 mRNA和蛋白的表達量顯著低于空白組(P<0.001)，Bax mRNA和蛋白的表達量顯著高于空白組(P<0.01)。見圖3。

圖3 SB203580對垂體瘤細胞凋亡的影響注：A～B.流式細胞術檢測SB203580對垂體瘤細胞凋亡的影響；C.RT-PCR檢測SB203580組細胞凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA的相對表達量；D.Western blot檢測SB203580組細胞凋亡因子Bcl-2、Bax蛋白的表達。與空白組比較，***P<0.01

2.4 SB203580促進垂體瘤細胞的遷移 TranswellTM實驗檢測結果顯示，與空白組相比較，SB203580組細胞遷移情況和細胞遷移數顯著高于空白組(P<0.01)，見圖4。

圖4 TranswellTM遷移實驗檢測SB203580對垂體瘤細胞的影響注：***與空白組比較，P<0.001

2.5 SB203580促進垂體瘤細胞NF-κB/MMP-9/VEGF通路的發生 Western blot實驗結果顯示，SB203580組垂體瘤細胞中NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白的表達量顯著高于空白組，見圖5。

圖5 SB203580對垂體瘤細胞NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白表達的影響

3 討論

垂體瘤是一種從垂體前葉和后葉及顱咽管上皮殘余細胞發生的腫瘤，垂體瘤通常發生于30歲左右，嚴重影響患者的日常生活能力[9]。探究能夠抑制垂體瘤細胞增殖能力以及細胞遷移能力的關鍵蛋白及研究促進垂體瘤細胞凋亡的機制是目前研究的焦點。

MAPK/ERK信號通路是腫瘤發生中重要的基因信號轉導通路，此通路與腫瘤細胞的增殖以及凋亡等過程密切相關[10]。有研究報道，MAPK/ERK相關抑制劑與一些腫瘤化學治療藥品相聯合，能夠對腫瘤細胞達到一定的抑制作用，增加腫瘤細胞對藥物的敏感性，還可以減少藥物的毒性，最終減少對患者身體的損傷[11]。因此，本研究首先通過CCK-8法確定了SB203580的最佳安全使用濃度，然后用適宜濃度的SB203580處理垂體瘤細胞后，通過Western blot檢測到垂體瘤細胞中纖維蛋白A的磷酸化水平下降，說明MAPK/ERK能夠誘導纖維蛋白A的磷酸化，參與垂體瘤細胞的發生發展過程。其次，通過CCK-8檢測SB203580處理垂體瘤細胞后細胞的增殖情況，發現抑制MAPK/ERK通路后，細胞的增殖能力升高，同時，通過RT-PCR、Western blot檢測細胞增殖的一些關鍵因子的表達，發現促進細胞增殖的蛋白CycinD1和CycinE1表達升高，抑制細胞增殖的蛋白p21表達下降，說明MAPK/ERK能夠抑制垂體瘤細胞的增殖。最后研究了MAPK/ERK對垂體瘤細胞凋亡和遷移的影響，抑制MAPK/ERK通路后，流式細胞術發現細胞凋亡數增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達下降，促凋亡蛋白Bax的表達升高，細胞的遷移能力升高，說明MAPK/ERK能夠抑制垂體瘤細胞的凋亡和遷移。因此，可以確定MAPK/ERK通過誘導纖維蛋白A的磷酸化抑制垂體瘤細胞的增殖、凋亡和遷移。

為了進一步研究MAPK/ERK抑制垂體瘤細胞增殖的相關機制，本研究選擇了NF-κB/MMP-9/VEGF通路進行研究，將SB203580處理垂體瘤細胞后，通過Western blot檢測到SB203580組中3個蛋白的表達量明顯高于空白組。有研究表明，此通路在腫瘤細胞增殖過程中發揮重要的作用[12-13]，說明MAPK/ERK能夠抑制NF-κB/MMP-9/VEGF通路的發生，最后抑制垂體瘤細胞的增殖，與本研究結果一致。

以上結果為研制能抑制垂體瘤細胞侵襲與發生的新的藥物提供了一定的思路，為進一步探究垂體瘤的發生發展機制提供了理論基礎。