石榴日輪丸質量標準提升研究

祿曉艷 楊金草

甘肅省甘南藏族自治州藥品檢驗檢測中心，甘肅 甘南 74700

石榴日輪丸為常用藏藥制劑(藏文讀音:索吉尼美吉廊日布)，由石榴子、冬葵果、肉桂、天門冬、黃精、西藏棱 子芹、蓽茇、喜瑪拉雅紫茉莉、紅花、蒺藜、豆蔻等 11 味藥材組成，具有溫補胃腎的功能,用于消化不良、腰腿冷痛、小便頻數、腳背浮腫、陽痿、遺精等，是治療胃、腎性病癥的常用藥之一，收載于衛生部藥品標準藏藥第一冊[1]，但標準項下只有顯微鑒別和丸劑的常規檢驗，沒有薄層鑒別和含量測定。方中石榴子及其活性成分鞣花酸均具有抗 癌、抗痢疾性腹瀉、抗氧化、降血糖和雌激素樣等藥理作用[2-3]；蓽茇屬溫里藥，具有溫中散寒、行氣止痛之功效，臨床適用于胃脘冷痛、胃寒嘔吐或泄瀉[4]，其主要活性成分胡椒堿具有催眠、鎮靜、抗驚厥、抗抑郁和骨骼肌松弛等作用臨床主要用于胃痛、腹瀉等[5]；紅花為活血化瘀的經典中藥之一，其有效成分羥基紅花黃色素A具有活血化瘀、抗炎、抗腫瘤等作用[6-7]。為了進一步控制該藥品質量，本實驗采用薄層色譜法(TLC)對石榴子、紅花進行定性鑒別[8]，用高效液相色譜法(HPLC)測定該制劑中蓽茇的有效成分胡椒堿含量。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 G7111A四元泵，Agilent 1260 G7115A二極管陣列檢測器,Agilent 1260 G7129A自動進樣器(內置柱溫箱)；BT224S、CP-225D電子天平；KH-250DB型數控超聲波清洗器；CAMAG WFH-201BJ薄層呈像系統(半自動點樣儀及數碼成像系統)。

1.2 試藥 胡椒堿對照品(批號：110775-201706，供含量測定用，純度 98.9%)；石榴子對照藥材(121431-201002，供薄層鑒別用)；紅花對照藥材(120907-201713，供薄層鑒別用)均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純，默克公司)；水為超純水，其余試劑均為分析純；硅膠GF254薄層板、高效硅膠H薄層板(青島海洋化工廠)；石榴日輪丸由甘南藏族自治州碌曲縣西倉寺院藏醫院(批號：190324、190502、190711、191006、191102)提供。

2 薄層鑒別試驗

2.1 石榴子TLC鑒別 取本品3批各1 g，加乙醇5 mL，超聲處理30 min，取上清液作為供試品溶液；另取石榴子對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液；再取缺石榴子的陰性對照1 g同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述供試品及陰性對照溶液各10 μL，對照藥材溶液3 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，而陰性對照無干擾，如圖1所示。

2.2 紅花TLC鑒別 取本品3批各1 g，加80%丙酮溶液5 mL，密塞，振搖15 min，靜置，取上清液作為供試品溶液；另取紅花對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液；再取缺紅花的陰性對照 1 g 同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述供試品、陰性對照溶液及對照藥材溶液各4 μL，分別點于同一高效硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，而陰性對照無干擾，如圖2所示。

3 胡椒堿含量測定

3.1 色譜條件及系統適應性 試驗色譜柱選用CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.06% 磷酸溶液(70∶30)；檢測波長：343 nm，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃，進樣量：對照品10 μL，供試品：5 μL；理論板數按胡椒堿峰計算應不低于5000。

3.2 對照品溶液的制備 取胡椒堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含胡椒堿0.2124 mg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備 取供試品5 g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，稱定重量，放置過夜，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3.4 陰性對照溶液的制備 按供試品的處方和制法，制成不含蓽茇的陰性樣品，按“3.3”項下的方法制得陰性對照溶液。

3.5 系統適用性試驗 分別精密吸取蓽茇陰性對照溶液、空白溶劑(甲醇)及流動相各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。結果：在蓽茇陰性對照溶液、空白溶劑(甲醇)及流動相色譜圖中，在與蓽茇對照品色譜峰相應的保留時間點，未見有色譜峰。結論：陰性無干擾，本品其他藥材、溶劑及輔料不干擾本品的胡椒堿含量測定，基線完全分離，且峰形良好，本方法的專屬性很好，如圖3所示。

3.6 線性關糸考察 分別精密吸取胡椒堿對照品溶液(濃度為0.2124mg·mL-1)4、6、8、10、12、15 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積積分值：以進樣量為橫坐標(X)，以峰面積積分值為縱坐標(Y)，分別作圖，得胡椒堿的線性回歸方程為：Y=8526.85X-29.1158，r=0.9999；結果表明，胡椒堿在0.850～3.186 μg之間線性關系良好。

3.7 儀器精密度試驗 取胡椒堿同一濃度對照品溶液，注入液相色譜儀，連續進樣6次，測定胡椒堿峰面積，RSD為0.25%，表明儀器的精密度良好。

3.8 重復性試驗 稱取同一樣品(批號：190324)按“3.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，進行高效液相色譜分析，測定含量，結果胡椒堿的RSD為0.47%。

3.9 穩定性試驗 取同一供試品溶液并于供試品溶液制備后2、4、6、8、12、24 h，分別進樣1次，測定峰面積值以考慮溶液的穩定性。結果在24 h內，供試品溶液中胡椒堿峰面積穩定，RSD為0.55%(n=6)，供試品溶液在24 h分析時間內穩定性良好。

3.10 加樣回收率試驗 取已知含量的石榴日輪丸供試品(批號：190324)0.5 g，精密稱定6份，分3組，每組2份，分別按樣品中胡椒堿含有量與相應對照品加入量的比例約為1∶0.8、1∶1、1∶1.2，加入胡椒堿對照品儲備液(0.2124 mg·mL-1)6.25、7.80、9.35 mL，按“3.3”項下方法制備供試品溶液，依上述色譜條件進行測定，計算回收率，測得的結果見表1。

表1 胡椒堿加樣回收率試驗結果 (n=6)

3.11 樣品的含量測定 取5批石榴日輪丸，按“3.3”項下方法制成供試品溶液。分別進樣，測得峰面積積分值，計算石榴日輪丸中胡椒堿的含量。結果見表2。

表2 石榴日輪丸中胡椒堿的測定結果 (n=3，mg·g-1)

結果表明：5批石榴日輪丸指標性成分胡椒堿含量差異較小，考慮到原料含量的差異、在生產過程中的損失以及試驗操作過程中的誤差，結合實際生產，轉移率按80%計算，并綜合考慮單味藥蓽茇的含量限度，建議本品胡椒堿的含量限度為：本品每1 g含胡椒堿(C17H19NO3)，不得少于2.0 mg。

4 討論

4.1 石榴子的薄層條件選擇 在石榴子的薄層鑒別中，比較了乙酸乙酯加熱回流提取和乙醇超聲提取，環已烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶12∶3)和石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9∶1)展開系統，硅膠G薄層板和硅膠GF254薄層板。結果表明，加熱回流和超聲提取效果基本一致，故選用簡便、快速的超聲提取，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9∶1)展開劑展開，斑點清晰。

4.2 紅花的薄層條件選擇 在紅花的薄層鑒別中，分別對硅膠G薄層板、硅膠H薄層板及高效硅膠H薄層板(展開劑：乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇7∶2∶3∶0.4)進行薄層色譜分析，結果以高效硅膠H板結果斑點清晰，分離度好，Rf值適中。

4.3 胡椒堿的流動相選擇 在流動相的優化中，參照文獻[9-12]，比較甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1磷酸溶液作為流動相時，胡椒堿的分離效果。結果表明，甲醇-0.1磷酸溶液作為流動相時，胡椒堿出峰時間較早，能夠獲得較好的分離效果，峰形對稱性較好，該方法專屬性強，測定結果準確可靠，重復性、相關性好，可用于石榴日輪丸的質量控制。

4.4 方法比較 根據科技查新報告，有關藏藥石榴日輪丸的質量標準研究方面，國內僅見四川大學華西藥學院王曙的“藏藥石榴日輪丸的質量標準研究”[8]，研究者對石榴日輪丸進行了薄層色譜鑒別和薄層掃描含量測定研究，本研究在其研究基礎上增加了石榴子的薄層色譜研究，并將胡椒堿的含量測定方法進行了改進。