淫羊藿苷對胰腺癌細胞BxPC-3增殖和凋亡的影響與miR-9上調有關①

黃群蓮 胡運春 陳永鈞 代良敏 代良萍

(西南醫科大學附屬醫院藥學部，瀘州 646000)

胰腺癌是一種診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤。在全世界范圍內，胰腺癌的發病率和死亡率很高，中國胰腺癌的死亡率高達88%[1]。盡管近年來醫學治療上取得了非常大的進展，但胰腺癌的死亡率并未得到明顯改善。一方面，其獨特的解剖位置使該疾病難以診斷；另一方面，大多數患者對化學療法產生抗藥性[2]。因此，胰腺癌患者需要更有效、毒性更小的治療方法。中藥化合物已成為胰腺癌患者體內調節腫瘤免疫微環境的重要抗癌藥物和輔助藥物來源。淫羊藿苷是一種植物類黃酮苷，是中藥材淫羊藿中有效的藥理成分。淫羊藿苷因其雌激素樣作用，對心腦血管系統、骨代謝、免疫和神經系統、性功能等具有廣泛的藥理作用，同時還發現其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[3]。已有研究表明淫羊藿苷可通過抑制腫瘤細胞的增殖和誘導腫瘤細胞的凋亡來抑制卵巢癌、肺癌、食管癌等多種癌癥的發展，但其對胰腺癌的作用尚不清楚[4]。miRNA是一類長度為20～24核苷酸的小型非編碼RNA，在細胞凋亡、代謝、細胞增殖以及分化等細胞中功能起關鍵作用。miR-9在乳腺癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤中表達失調，發揮抑癌或致癌作用。已有研究表明，miR-9-5p在胰腺癌組織和細胞系中顯著下調，這與胰腺癌患者生存時間較短有關[5]。因此，上調miR-9有望抑制胰腺癌的發展。本文利用體外培養的胰腺癌細胞來研究淫羊藿苷對胰腺癌細胞增殖和凋亡的作用及機制，為淫羊藿苷在臨床上治療胰腺癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 淫羊藿苷(HPLC≥98%，成都博瑞特化學技術有限公司，貨號：110583)；順鉑(浙江聯碩生物科技有限公司，貨號：PHR1624)；RPMI-1640培養基(上海慧穎生物科技有限公司，貨號：C22400500BT)；胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液(上海素爾生物科技有限公司，貨號：16000-044、15140122)；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒(上海信裕生物工程有限公司，貨號：111105-500)；BCA試劑盒(上海易色醫療科技有限公司，貨號：BC201)；活化的胱天蛋白3(cleaved caspase-3)抗體、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(碧云天生物科技有限公司，貨號：AC030-1、AB026、AB112、AF0003)；辣根過氧化物酶標記的二抗、Ki67和增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體(上海艾博抗生物科技有限公司，貨號：ab6728、ab15580、ab92552)；Lipofectamine 2000轉染試劑(上海聯碩生物科技有限公司，貨號：11668-019)；miR-9 inhibitor質粒及各種引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成；SYBR-Green PCR試劑盒(蘇州英弗基因科技有限公司，貨號：INFG801-01)；cDNA逆轉錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：BTN60906)。

1.1.2儀器 流式細胞儀購自美國BD公司；MuLTI SKAN GO 型全自動酶標儀購自上海智理科學儀器有限公司；K8500全自動凝膠成像系統購自南京世研儀器。

1.1.3細胞及培養 胰腺癌BxPC-3細胞購自美國典型培養物保藏中心，于RPMI1640培養基(含體積分數為10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和100 μg/ml 的鏈霉素)，在體積分數為5% CO2條件下37℃恒溫培養箱中培養。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測細胞活性 在96孔板中，將胰腺癌BxPC-3細胞分別用不同濃度淫羊藿苷(0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)處理24 h、48 h、72 h、96 h時，再用10 μl MTT染料處理細胞，然后與100 μl二甲基亞砜孵育15 min，用酶免疫分析儀在490 nm處測量光密度。用各濃度處理組細胞吸光值與 0 μmol/L 組細胞的光密度表示細胞活性。

1.2.2分組及處理 將BxPC-3細胞分為對照組、淫羊藿苷12.5、25、50 μmol/L組、順鉑10 μmol/L組、miR-9 inhibitor組、淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組。對照組、淫羊藿苷12.5、25、50 μmol/L組BxPC-3細胞用終濃度含有Icariin 0、12.5、25、50 μmol/L 培養基培養；順鉑10 μmol/L組BxPC-3細胞用終濃度含有順鉑 10 μmol/L培養基培養；miR-9 inhibitor組和淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組利用Lipofectamine 2000將100 nmol/L的miR-9 inhibitor質粒轉染進入胰腺癌BxPC-3細胞后，用終濃度含有淫羊藿苷0或50 μmol/L培養基培養。

1.2.3克隆形成實驗檢測細胞生長 將胰腺癌BxPC-3細胞接種于6孔板(1×106個/孔)，繼續培養14 d，其間每隔3 d進行換液并觀察細胞狀態，體積分數為4%多聚甲醛固定30 min，質量體積分數為0.25% 結晶紫染色20 min，計數菌落數量。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 將胰腺癌BxPC-3細胞處理48 h后，胰酶消化胰腺癌BxPC-3細胞，12 000 r/min離心5 min，按1×106個/ml的濃度重懸胰腺癌BxPC-3細胞。在胰腺癌BxPC-3細胞懸液中加入5 μl FITC標記的膜聯蛋白V和5 μl碘化丙啶，暗環境孵化15 min，然后通過流式細胞儀分析細胞凋亡情況。細胞凋亡率(%)=早期細胞凋亡率(%)+晚期細胞凋亡率(%)。

1.2.5蛋白印跡法檢測Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平 用RIPA裂解液提取各組胰腺癌BxPC-3細胞的總蛋白，并通過BCA試劑盒檢測蛋白濃度。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，用半干轉膜儀將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜，并在室溫下，用脫脂牛奶封閉2 h。接著加入兔來源的單克隆一抗(Ki67 1∶1 000、PCNA 1∶1 000、cleaved caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶500、Bcl-2 1∶1 000)，在4℃封閉過夜。然后加入對應山羊抗兔單克隆二抗(1∶2 000)，室溫封閉1 h。最后滴電化學發光液曝光，以GAPDH為內參，使用Quantity One軟件分析目標蛋白質的相對表達水平。

1.2.6RT-qPCR檢測miR-9 mRNA的表達 通過QIAzol裂解試劑提取1.2.2中各組胰腺癌BxPC-3細胞的總RNA，再通過cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，并按照SYBR-Green PCR試劑盒說明書操作進行miR-9 mRNA測定。反應條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環，用U6標準化。miR-9的上游引物序列：5′-GAGACATAGGTATCTTGTCCC-3′，miR-9的下游引物序列：5′-GCTTAGGACTAGGGACTCAACC-3′；U6的上游引物序列：5′-GTGGTCCGCGTAGCGAGT-3′，U6的下游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACAT-3′。

2 結果

2.1淫羊藿苷抑制胰腺癌BxPC-3細胞增殖 如圖1所示：各不同濃度組胰腺癌BxPC-3細胞吸光值隨時間變化逐漸出現差異，在24 h時，與0 μmol/L 組相比，50和100 μmol/L 組胰腺癌BxPC-3細胞吸光值明顯減少(P<0.05)；在48 h時，與0 μmol/L組相比，25、50和100 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞吸光值明顯減少(P<0.05，P<0.01)；在72 h時，與0 μmol/L組相比，12.5、25、50和100 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞吸光值明顯減少(P<0.05，P<0.01)。選擇淫羊藿苷12.5、25、50 μmol/L進行后續實驗。

圖1 MTT法檢測不同濃度淫羊藿苷處理不同時間對胰腺癌BxPC-3細胞增殖的影響

如圖2所示：與對照組相比，淫羊藿苷12.5 μmol/L 組胰腺癌BxPC-3細胞克隆細胞數目及增殖標記蛋白PCNA和Ki67表達無明顯變化，淫羊藿苷 25 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞克隆細胞數目減少(P<0.05)、增殖標記蛋白PCNA和Ki67表達下調(P<0.05)，淫羊藿苷 50 μmol/L和順鉑10 μmol/L 組克隆胰腺癌BxPC-3細胞數目顯著減少(P<0.01)，增殖標記蛋白PCNA和Ki67表達顯著下調(P<0.01)。

圖2 不同濃度淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞增殖的影響

2.2淫羊藿苷誘導胰腺癌BxPC-3細胞凋亡 如圖3所示：與對照組相比，淫羊藿苷12.5 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞凋亡率及凋亡標記相關蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3表達均無明顯變化，淫羊藿苷 25 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞凋亡率及凋亡標記相關蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表達增加(P<0.05)、凋亡標記相關蛋白Bcl-2表達下調(P<0.05)，淫羊藿苷 50 μmol/L和順鉑10 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞凋亡率及凋亡標記相關蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表達顯著增加(P<0.01)、凋亡標記相關蛋白Bcl-2表達顯著下調(P<0.01)。

圖3 不同濃度淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞凋亡的影響

2.3淫羊藿苷上調胰腺癌BxPC-3細胞miR-9的表達 如圖4A所示：與對照組相比，淫羊藿苷12.5 μmol/L 和順鉑 10 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞miR-9表達無明顯變化，淫羊藿苷 25 μmol/L 組胰腺癌BxPC-3細胞miR-9表達上調(P<0.05)，淫羊藿苷50 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞miR-9表達明顯上調(P<0.01)。如圖4B所示：與對照組相比，淫羊藿苷 50 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞miR-9表達明顯上調(P<0.01)，miR-9 inhibitor組胰腺癌BxPC-3細胞miR-9表達明顯下調(P<0.01)；與miR-9 inhibitor組相比較，淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組胰腺癌BxPC-3細胞miR-9表達明顯上調(P<0.01)。

圖4 RT-qPCR檢測不同濃度淫羊藿苷對miR-9 mRNA表達影響

2.4淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞增殖抑制作用與miR-9上調有關 如圖5所示：與對照組相比，淫羊藿苷 50 μmol/L組克隆胰腺癌BxPC-3細胞數目顯著減少(P<0.01)、增殖標記蛋白PCNA和Ki67表達顯著下調(P<0.01)，miR-9 inhibitor組克隆胰腺癌BxPC-3細胞數目顯著增加(P<0.01)、增殖標記相關蛋白PCNA和Ki67表達顯著上調(P<0.01)；與miR-9 inhibitor組相比較，淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組克隆胰腺癌BxPC-3細胞數目顯著減少(P<0.01)、增殖標記相關蛋白PCNA和Ki67表達顯著下調(P<0.01)。

圖5 淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞增殖抑制作用與miR-9上調有關

2.5淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞凋亡誘導作用與miR-9上調有關 如圖6所示：與對照組相比，淫羊藿苷 50 μmol/L組胰腺癌BxPC-3細胞凋亡率及凋亡標記相關蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表達顯著增加(P<0.01)、凋亡標記相關蛋白Bcl-2表達顯著下調(P<0.01)，miR-9 inhibitor組胰腺癌BxPC-3細胞凋亡率及凋亡標記相關蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表達顯著減少(P<0.01)、凋亡標記蛋白Bcl-2表達顯著上調(P<0.01)；與miR-9 inhibitor組相比較，淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor組胰腺癌BxPC-3細胞凋亡率及凋亡標記相關蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達顯著增加(P<0.01)、凋亡標記相關蛋白Bcl-2表達顯著下調(P<0.01)。

圖6 淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞凋亡誘導作用

3 討論

胰腺癌是最致命的惡性腫瘤之一，由于其表現較晚，癥狀不明確，缺乏有效的篩查手段，確診時已經為晚期[6]。手術切除是胰腺癌的常用療法，但是，只有大約20%的胰腺癌可以手術切除，其余的胰腺癌患者不得不依靠放射線和化學療法，但是這些療法產生的治療效果小，存活率低[7]。胰腺癌預后很差，總體5年生存率只有5%～6%[8]。因此，急需開發治療胰腺癌的新藥物。淫羊藿苷是一種從中藥材淫羊藿中提取的植物類黃酮苷，具有調節免疫、抗抑郁、改善心血管功能等多種藥理活性。且已有眾多研究表明，淫羊藿苷具有廣泛的抗癌活性，可以有效地靶向癌癥干細胞和耐藥癌細胞，其作用機制包括細胞增殖凋亡及周期的調節、細胞侵襲遷移的調節、抗血管生成、抗轉移和免疫調節等[9]。如，淫羊藿苷通過調節內質網應激介導的凋亡信號，對人食管癌細胞具有抗癌作用[10]；淫羊藿苷通過激活AKT/mTOR/ATG5途徑抑制自噬，增強順鉑耐藥卵巢癌細胞的化學敏感性[11]。本研究發現，淫羊藿苷呈劑量依賴性抑制胰腺癌BxPC-3細胞增殖，并誘導BxPC-3細胞凋亡。

腫瘤細胞具有增殖速度快并無限復制的特性，抑制腫瘤細胞的增殖能力可有效抑制腫瘤的發展。已有報道，淫羊藿苷可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路激活來抑制非小細胞肺癌A549細胞的增殖[12]。PCNA和Ki67是目前運用最為廣泛的增殖標記蛋白，其表達量和細胞的增殖能力成正比[13]。本研究發現，淫羊藿苷減少胰腺癌BxPC-3細胞克隆細胞數目，下調增殖標記蛋白PCNA和Ki67表達。因此，淫羊藿苷抑制胰腺癌BxPC-3細胞增殖。在正常機體中，細胞增殖與凋亡是處于動態平衡的，而在腫瘤細胞中，細胞增殖與凋亡是失衡的[14]。凋亡是一種程序性細胞死亡的形式，具有復雜多樣的潛在機制。當細胞受到物理刺激、藥物或放射線刺激時，它們會通過受體將這些信號轉移到細胞內環境中。惡性腫瘤通常表現出凋亡失調現象。已有研究表明，淫羊藿苷通過mTOR信號通路抑制卵巢癌SKVCR細胞自噬，并促進細胞凋亡[15]。本研究表明，淫羊藿苷增加胰腺癌BxPC-3細胞凋亡率及凋亡標記蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表達，下調凋亡標記蛋白Bcl-2表達。Caspase-3是最關鍵的凋亡執行者[16]。Bcl-2可抑制細胞色素C的釋放及caspase-3的激活，并可拮抗促凋亡基因Bax，抑制細胞的凋亡[17-18]。因此，淫羊藿苷誘導胰腺癌BxPC-3細胞凋亡。

眾所周知，miRNA在細胞遺傳學中起著重要的作用。在腫瘤發生和發展的過程，其與腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化和轉移有關。最近的研究報道，淫羊藿苷通過下調甲狀腺癌細胞中miR-625-3p來抑制細胞增殖、遷移和侵襲[19]。已有研究報道，miR-9-5p在胰腺癌組織和細胞系中顯著下調，過表達miR-9-5p可以顯著抑制胰腺癌BxPC-3細胞的增殖和侵襲[20]。本研究發現，淫羊藿苷上調胰腺癌BxPC-3細胞miR-9的表達，抑制miR-9表達可逆轉淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞增殖和凋亡的作用。而陽性對照藥物順鉑對胰腺癌BxPC-3細胞miR-9的表達并無影響。這說明雖然陽性對照藥物順鉑與淫羊藿苷對胰腺癌BxPC-3細胞增殖和凋亡具有類似的作用效果，但是其作用機制卻有所不同。淫羊藿苷可通過上調miR-9抑制胰腺癌BxPC-3細胞增殖，并誘導BxPC-3細胞凋亡。

綜上所述，淫羊藿苷抑制胰腺癌BxPC-3細胞增殖，并誘導BxPC-3細胞凋亡，這與miR-9上調有關。本研究僅為體外細胞實驗和機制的初步探討，體內實驗和更為詳細的相關分子通路機制有待進一步研究。