LncRNA TMPO-AS1通過調節miR-204-3p影響肺癌細胞的增殖、凋亡和侵襲

鄧俊亮 華美香 陳鍵騰

(南方醫科大學附屬新會醫院呼吸內科，江門 529100)

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，是全球范圍內與癌癥相關死亡的主要原因。根據肺癌的分化程度和形態特征，其可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，在所有肺癌患者中，有85%是非小細胞肺癌[1]。大多數非小細胞肺癌患者表現為局部晚期或轉移性疾病，可選擇的治療方式有限，導致患者的5年總生存率較低[2]。因此，了解非小細胞肺癌的發病機制，尋找新的治療對提高患者生存率具有重要意義。越來越多的證據表明，非小細胞肺癌的發生和發展涉及許多分子變化，例如由表觀遺傳調控誘導的基因表達的改變[3-4]。近年來，已有研究證明長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)直接參與腫瘤的發展和轉移過程[5]。胸腺生成素反義轉錄本1(thymopoietin antisense transcript 1，TMPO-AS1)是一種與DNA復制和細胞周期進程密切相關的lncRNA[6]。ZHENG等[7]分析了來自癌基因組圖譜的肺腺癌患者的lncRNA表達譜和臨床數據顯示，TMPO-AS1在肺腺癌患者中呈高表達，且與患者預后密切相關。PENG等[8]的研究同樣顯示，TMPO-AS1可能是肺腺癌預后的標志分子。然而，目前未見TMPO-AS1在肺癌中的作用及可能機制的研究。生物信息學預測發現，TMPO-AS1和miR-204-3p間存在靶向結合位點，但TMPO-AS1和miR-204-3p是否存在靶向關系調控肺癌細胞的增殖、凋亡和侵襲鮮有報道。因此，本實驗探究TMPO-AS1對肺癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響及對miR-204-3p的靶向關系。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌細胞系A549、H1975、H1299和H1650和人正常支氣管上皮細胞系HBE(美國ATCC)；DMEM培養基、MTT試劑(美國Gibco公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素混合液(美國Abcam公司)；LipofectamineTM2000轉染試劑(美國Intvitrogen公司)；TMPO-AS1 siRNA及陰性對照siRNA control(上海吉凱制藥技術有限公司)；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)；miR-204-3p-Wt和miR-204-3p-Mut熒光素酶重組載體質粒(上海生工生物工程有限公司)；熒光素酶報告檢測試劑盒(美國Promega公司)；TMPO-AS1過表達重組載體質粒及空載質粒(北京賽百盛基因技術有限公司)；PCNA、Ki-67、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、MMP-2和MMP-9單抗及HRP標記的二抗(英國Abcam公司)；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(日本TaKaRa公司)；Transwell小室(美國Coring公司)；細胞裂解液、BCA試劑盒、超敏ECL發光試劑(碧云天生物技術研究所)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養液培養A549、H1975、H1299、H1650和HBE細胞，放置在37℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養箱中常規培養。每2 d換液，待細胞生長匯合率至80%以上時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取指數增殖期的細胞用于實驗研究。

1.2.2細胞轉染 生長狀態良好的肺癌A549細胞接種到6孔板中，過夜培養，待細胞匯合度達50%時，使用LipofectamineTM2000轉染試劑將TMPO-AS1 siRNA或陰性對照siRNA control轉染至A549細胞，具體步驟參照轉染試劑說明書。將轉染TMPO-AS1 siRNA的A549細胞命名為si-TMPO-AS1組，轉染siRNA control的A549細胞命名為si-NC組，轉染空脂質體的A549細胞命名為Control組，三組A549細胞轉染48 h行qPCR檢測。

1.2.3qPCR檢測 收集對數生長期的A549、H1975、H1299、H1650和HBE細胞以及轉染48 h三組A549細胞，使用Trizol試劑分別抽提總RNA，純化RNA，并使用分光光度計檢測RNA樣品的純度和豐度。使用逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒行qPCR檢測，反應體系為：cDNA 2 μl、2×SYBR Green Mix 10 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、ddH2O 6 μl。反應程序為：95℃ 5 min；隨后95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 10 s循環40次。以GADPH為內參檢測細胞中TMPO-AS1的表達水平，以U6為內參檢測細胞中miR-204-3p的表達水平。所用引物序列：TMPO-AS1正向引物：5′-TCAAACCCGTATTACCGATCCA-3′，反向引物：5′-ACCCTACATCCAAGGTCTCCT-3′；GADPH正向引物：5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，反向引物：5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′；miR-204-3p正向引物：5′-CGCTCGAGCCTTCTTCCTTGCCTCTCA-3′；反向引物5′-CAGCGGCCGCGTAAAATTTGACATGGAC-3′。U6正向引物：5′-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3′；反向引物：5′-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3′。反應結束后分別獲得目的基因和內參基因的Ct值，采用相對定量2-ΔΔCt法進行分析。實驗獨立重復3次。

1.2.4熒光素酶報告實驗 在線生物信息學軟件LncBase Experimental v.2預測TMPO-AS1在miR-204-3p上的結合位點。依據預測結果擴增miR-204-3p上含有及突變的TMPO-AS1結合位點的片段，并插入到熒光素酶報告載體上(分別為miR-204-3p-Wt和miR-204-3p-Mut熒光素酶重組載體質粒)，該部分由上海生工生物工程有限公司完成。用miR-204-3p-Wt和miR-204-3p-Mut分別與TMPO-AS1過表達重組載體質粒或空載質粒共同轉染A549細胞，繼續培養48 h，根據熒光素酶報告檢測試劑盒分別測定熒光素酶活性，計算各組細胞中相對熒光素酶活性，實驗獨立重復3次。

1.2.5MTT檢測 對數期的A549細胞接種到96孔板中，待細胞匯合率至50%時按照1.2.2進行轉染，Control組、si-NC組和si-TMPO-AS1組A549細胞轉染48 h時，向每孔細胞加入20 μl MTT溶液，隨后放置在37℃培養箱常規培養4 h，取出細胞培養板，吸取細胞上清液，再加入150 μl二甲基亞砜，充分混勻后放置到振蕩儀上反應10 min，使用酶標儀測定各孔吸光度值(A值)，分別計算三組A549細胞活性，細胞活性(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。實驗獨立重復3次。

1.2.6流式細胞術檢測 A549細胞按照1.2.2轉染48 h后，分別收集三組細胞約1×105個，向細胞中加入Binding Buffer緩沖液500 μl重懸細胞，制成單細胞懸液，將500 μl細胞懸液加入流式管中，再分別向流式管中加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI染液，混勻后于室溫下避光反應15 min，在1 h內使用流式細胞儀檢測，分析三組A549細胞凋亡率，實驗獨立重復3次。

1.2.7Transwell侵襲實驗 轉染后三組A549細胞用胰蛋白酶消化，收集細胞，用不含血清的培養液重懸細胞，饑餓處理24 h，將細胞濃度調整為2×105個/ml，取200 μl細胞懸液接種到Matrigel膠預先包被的Transwell小室的上室，在小室下層添加500 μl含10%血清的培養液，放置在37℃常規培養箱繼續孵育48 h。取出小室，用濕潤的棉簽擦去上層未穿過基底膜的細胞，用多聚甲醛固，結晶紫染色，顯微鏡下觀察并計數，實驗重復3次，統計三組A549細胞穿膜細胞數目。

1.2.8Western blot檢測 使用細胞裂解液分別提取轉染48 h三組A549細胞總蛋白，采用BCA試劑盒對蛋白樣品進行濃度測定并調平。配制10%的SDS-PAGE凝膠，取等量蛋白上樣，電泳分離蛋白后轉印到PVDF膜上。實驗5%脫脂奶粉室溫封阻2 h，洗膜并加入相應一抗，根據說明書將PCNA和Ki-67一抗1∶500稀釋，Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9一抗1∶600稀釋，MMP-2和MMP-9一抗1∶800稀釋，4℃過夜孵育。第2天洗膜后再加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育1.5 h，洗膜后滴加超敏ECL顯色液，在暗室顯影曝光，采集圖像，使用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內參，實驗重復3次。

2 結果

2.1TMPO-AS1在肺癌細胞系中的表達 qPCR結果顯示，與人正常支氣管上皮細胞系HBE比較，人肺癌細胞系A549、H1975、H1299和H1650中TMPO-AS1的表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1。在肺癌細胞系中A549細胞中TMPO-AS1的表達水平最高，因此后續實驗選其為研究對象。

表1 TMPO-AS1在HBE細胞系和不同肺癌細胞系中的表達

2.2TMPO-AS1對miR-204-3p表達的影響 qPCR結果顯示，與si-NC組相比，si-TMPO-AS1組A549細胞TMPO-AS1的表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-204-3p的表達水平明顯升高(P<0.05)；與Control組相比，si-NC組中TMPO-AS1和miR-204-3p的表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 三組A549細胞中TMPO-AS1和miR-204-3p的表達比較

2.3TMPO-AS1靶向結合miR-204-3p 生物信息學預測顯示，TMPO-AS1與miR-204-3p序列存在連續結合位點，說明TMPO-AS1和miR-204-3p可能存在靶向關系。熒光素酶報告實驗結果顯示，TMPO-AS1能夠明顯降低野生型miR-204-3p細胞的相對熒光素酶活性(P<0.05)，對突變型miR-204-3p細胞的相對熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。見圖1。

圖1 TMPO-AS1靶向miR-204-3p

2.4沉默TMPO-AS1對A549細胞增殖能力的影響 MTT實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-TMPO-AS1組A549細胞活性顯著降低(P<0.05)；與Control組相比，si-NC組A549細胞活性差異無統計學意義(P>0.05)。Western blot實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-TMPO-AS1組A549細胞中增殖相關蛋白PCNA和Ki-67的表達顯著下調(P<0.05)；與Control組相比，si-NC組A549細胞中PCNA和Ki-67的表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2和表3。

表3 三組A549細胞活性及PCNA和Ki-67的表達水平比較

圖2 Western blot檢測三組A549細胞中PCNA和Ki-67蛋白的表達

2.5沉默TMPO-AS1對A549細胞凋亡率的影響 流式細胞術實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-TMPO-AS1組A549細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與Control組相比，si-NC組A549細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。Western blot實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-TMPO-AS1組A549細胞中凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達顯著上調(P<0.05)；與Control組相比，si-NC組A549細胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3和表4。

表4 三組A549細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達水平比較

圖3 沉默TMPO-AS1對A549細胞凋亡的影響

2.6沉默TMPO-AS1對A549細胞侵襲能力的影響 Transwell實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-TMPO-AS1組A549細胞侵襲數目明顯下降(P<0.05)；與Control組相比，si-NC組A549細胞侵襲數目差異無統計學意義(P>0.05)。Western blot實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-TMPO-AS1組A549細胞中侵襲相關蛋白MMP-2和MMP-9的表達顯著降低(P<0.05)；與Control組相比，si-NC組A549細胞中MMP-2和MMP-9的表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4和表5所示。

表5 三組A549細胞穿膜數目及MMP-2和MMP-9的表達水平比較

圖4 沉默TMPO-AS1對A549細胞侵襲能力的影響

3 討論

非小細胞肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，在男性中發病率更高，也是我國常見的惡性腫瘤[9]。近來，盡管在非小細胞肺癌的臨床治療方面已經取得了很大的進步，但是患者的總生存時間并沒有顯著改善，并且一個關鍵的問題是缺乏有價值的生物分子標志物[10]。因此，迫切需要了解非小細胞肺癌進展和轉移的分子機制，以改善疾病發作時的診斷和有效治療。lncRNA作為一種非蛋白質的轉錄本，通常被定義為長度超過200個核苷酸，最近引起了越來越多學者的關注。越來越多的證據表明，lncRNA可能在多種癌癥的生物學過程中發揮關鍵作用，并作為包括預后生物標志物和潛在治療靶標在內的許多臨床應用的基礎[11-12]。最近有報道顯示，lncRNA的異常表達可能與表觀遺傳學改變有關，并參與了癌細胞的增殖和轉移[13]。TMPO-AS1作為TMPO反義轉錄本1，廣泛參與調控細胞的增殖過程。目前有證據表明，TMPO-AS1在人類惡性腫瘤的進展中發揮重要作用，且與患者預后不良密切相關。如TMPO-AS1在前列腺癌中過度表達，能夠促進腫瘤的進展，且被認為是前列腺癌預后不良的標志物[14]。本實驗通過qPCR檢測發現，TMPO-AS1在人肺癌細胞系中的表達顯著高于人正常支氣管上皮細胞系，這提示TMPO-AS1可能在肺癌細胞中發揮致癌基因的作用。選取TMPO-AS1表達量最高的肺癌A549細胞為研究對象，通過轉染TMPO-AS1 siRNA沉默其表達，結果發現，沉默TMPO-AS1后A549細胞增殖和侵襲能力顯著降低，增殖相關蛋白PCNA和Ki-67的表達明顯下調，凋亡率明顯升高，凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達明顯上調，表明TMPO-AS1在肺癌中發揮促癌的作用。這與以往QIN等[15]關于TMPO-AS1通過調節其自然反義轉錄物TMPO促進非小細胞肺癌的進展的研究相符。

研究顯示，微小RNA(microRNA，miRNA)可以調節各種生物學過程，并在癌癥的發展和轉移中發揮關鍵作用[16]。有趣的是，在包括癌癥在內的許多疾病中都發現了miRNA和lncRNA之間的交叉調控。miRNA可以靶向lncRNA以降低lncRNA的穩定性，而lncRNA也可以充當競爭性內源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)來拮抗miRNA或lncRNA[17]。已發現miR-204-3p在幾種腫瘤中表達失調，例如胃癌、神經膠質瘤和卵巢癌，參與調控腫瘤的發生和發展[18-20]。在透明細胞腎細胞癌中具有較高miR-204-3p表達的患者的總生存期則明顯更高，ERβ通過改變ERβ/circATP2B1/miR-204-3p/FN1信號軸來促進透明細胞腎細胞癌細胞的侵襲[21]。一項研究顯示，miR-204-3p在頭頸部腫瘤中作為抑癌基因發揮作用，能夠抑制頭頸部腫瘤的轉移[22]。研究顯示，miR-204-3p在肺癌組織中呈低表達，與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移等密切相關[23-24]。本研究首先通過生物信息學預測發現TMPO-AS1和miR-204-3p存在相似結合位點，沉默TMPO-AS1后A549細胞中miR-204-3p的表達明顯升高，通過熒光素酶報告實驗驗證了TMPO-AS1和miR-204-3p存在靶向調控關系。本研究結果顯示沉默TMPO-AS1表達后可明顯促進miR-204-3p的表達，沉默TMPO-AS1可抑制肺癌A549細胞的增殖和侵襲，并促進細胞凋亡，提示沉默TMPO-AS1表達可能靶向上調miR-204-3p的表達而抑制PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9表達及促進Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達從而抑制肺癌A549細胞的增殖和侵襲，并促進細胞凋亡。

綜上，TMPO-AS1在肺癌細胞系中呈高表達，沉默TMPO-AS1可通過誘導miR-204-3p的表達抑制肺癌A549細胞增殖和侵襲能力，促進細胞凋亡。本實驗為進一步了解非小細胞肺癌發病機制及探索潛在的治療靶點提供一定的實驗依據。