土壤中頭孢噻呋的高效液相色譜檢測方法的建立

安博宇，徐向月，霍美霞，馬文瑾，王涵宇，劉振利，程古月,*，黃玲利,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學國家獸藥殘留基準實驗室(HZAU)，農(nóng)業(yè)部食品獸藥殘留檢測重點實驗室，華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢430070)

當今抗生素尤其是獸用抗生素對環(huán)境的污染受到了世界各國的廣泛關注，其存在于環(huán)境中不僅會對動植物和微生物造成毒性，也會誘導環(huán)境微生物產(chǎn)生耐藥性并傳播。我國作為抗生素的使用大國，僅在2018年我國獸用抗生素使用的總量就高達29774.09噸[1]。如此大量的獸用抗生素經(jīng)過動物體排入環(huán)境后，勢必會對土壤或水體環(huán)境造成嚴重的污染[2]。頭孢噻呋(Ceftiofur)又名賽德福，是20世紀80年代由美國普強公司開發(fā)并被批準應用于治療動物細菌性疾病的第三代頭孢菌素類藥物[3-4]。由于其抗菌活性強，毒性較低，副作用較小，因此，成為市場上應用最為廣泛的獸用頭孢菌素類藥物。由于我國不合理用藥的現(xiàn)象比較常見，臨床上的病原對其耐藥性現(xiàn)象十分嚴重。因此，人們不僅要關注臨床用藥的合理規(guī)范，也要注意抗生素對環(huán)境的污染以及對環(huán)境微生物耐藥基因的誘導作用[5-7]。根據(jù)之前的研究，頭孢噻呋在動物用藥后，約20%～30%的活性物質(zhì)會隨糞便和尿液排入環(huán)境[4]，這些化合物以原型藥物為主，其進入環(huán)境后不僅會影響微生物群落結(jié)構(gòu)，也會誘導耐藥基因的產(chǎn)生，因此，對其環(huán)境污染的研究是非常有必要的[8]。對于頭孢噻呋的檢測方法，目前研究較多的是在組織和血漿中[9-12]，而在環(huán)境樣品(糞便、堆肥、污水)中的檢測研究較少[13-16]。目前環(huán)境樣品中抗生素的檢測最常見的是高效液相色譜法(HPLC)和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)。這兩種方法中HPLC-MS/MS方法具有更好的靈敏度，相比于HPLC法其儀器價格昂貴，成本較高[17]。HPLC分析方法具有應用范圍廣，成本較低，更穩(wěn)定等特點，被廣泛應用于物質(zhì)的定量分析。本研究選擇砂土、壤土、砂壤土、黏土4種不同類型的土壤為研究對象，開發(fā)了土壤中頭孢噻呋的定量檢測方法，以期為頭孢噻呋及其同類藥物環(huán)境行為研究提供方法學參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、耗材與試劑 Waters 2998高效液相色譜儀(配備PDA檢測器)；萬分之一電子天平(SQP，購自北京賽多利科學儀器有限公司)；Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)色譜柱；固相萃取裝置；微型渦旋振蕩器(WX-80A，購自上海滬西分析儀器廠有限公司)；超聲波清洗機(KQ-3200，購自昆山市超聲儀器有限公司)；Waters Oasis HLB固相萃取柱(3cc/60 mg，Waters公司)；高速冷凍離心機(HITACHI CR21G，日立公司)；純水儀(購自美國Milli-Q公司)；分析天平(型號AW120，購自日本SHIMADZU公司)。

頭孢噻呋標準品(純度≥89.5%)，購自湖北賽因斯實驗設備有限公司，100 mg；硼酸鈉；氯化鉀；甲醇和乙腈均為HPLC級；三氟乙酸、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、乙酸乙酯等試劑均為分析純。

1.2 標準溶液及提取液的配置 準確稱取頭孢噻呋標準品11.2 mg，溶解在2 mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入超純水定容至10 mL，配置成濃度為1000 μg/mL的標準儲備液，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

硼酸緩沖液：稱取3.7 g氯化鉀和19 g四硼酸鈉，用超純水溶解并定容至1 L(pH為9)。

1.3 供試土壤樣品的采集及理化性質(zhì) 土壤采自華中農(nóng)業(yè)大學水稻田邊土壤，黏土采自華中農(nóng)業(yè)大學水稻田池塘邊土壤，砂壤土采自華中農(nóng)業(yè)大學獅子山上，砂土采自武漢白沙洲大橋附近。以上土壤使用多點采樣法從表層土壤頂部0～20 cm收集三個子樣本混合在一起得到復合樣本，自然風干。其中一部分過2 mm篩用于土壤實驗，另一部分過1 mm篩用于測定土壤的基本理化形式。土壤顆粒組成用比重法測定，陽離子交換量(CEC)使用乙酸銨法測定，有機質(zhì)含量(OC)使用重鉻酸鉀容量法測定，土壤pH使用電位法測定(水土比=5∶1)。上述土壤經(jīng)檢測不含目標抗生素。四種土壤的相應理化性質(zhì)見表1。

表1 四種土壤的理化性質(zhì)

1.4 樣品提取與凈化 稱取土壤1 g和0.15 g Na2EDTA于10 mL離心管中，加入硼酸緩沖液4 mL，渦旋2 min混勻，超聲10 min，10000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一只10 mL離心管中。再分別加相同量提取液重復提取一次。進行固相萃取，取固相萃取HLB柱(60 mg，3cc)依次用3 mL 甲醇、3 mL 超純水活化。樣品過柱，過完后用2 mL超純水淋洗，真空條件下干燥5 min，再用3 mL甲醇洗脫兩次，收集洗脫液，40 ℃水浴氮氣吹干，用1 mL初始流動相[0.1%三氟乙酸：乙腈=4∶1(V∶V)]復溶，溶液過0.22 μm微孔濾膜，HPLC分析。

1.5 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱(4.6×250 mm)；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；波長295 nm；進樣量20 μL；流動相：A相為0.1%三氟乙酸，B相為乙腈，梯度洗脫程序見表2。

表2 液相色譜梯度洗脫比例

1.6 方法性能考核

1.6.1 標準曲線的制備 根據(jù)頭孢噻呋在環(huán)境中可能出現(xiàn)的濃度，將標準曲線的范圍設置為0.05～10 μg/mL，取4 mL離心管數(shù)只配置成含有頭孢噻呋濃度為0.05、0.2、1、5、10 μg/mL的藥液1 mL，取20 μL進行HPLC檢測，繪制加藥濃度與峰面積的曲線圖，考察方法的線性關系，并得出回歸方程。

1.6.2 準確度和精密度 1 g空白土壤樣品分別添加0.05、0.1、1 μg/g的頭孢噻呋，作為低、中、高濃度，按照樣品前處理的步驟處理后進行HPLC測定，每個濃度設置5個重復，通過單點校正法進行回收率的測定，作為準確度考核結(jié)果。這些樣品每天重復走樣三次，連續(xù)測定3 d，得出日內(nèi)和日間變異系數(shù)作為該方法的精密度考核。

1.6.3 檢測限和定量限 1 g空白土壤中加入一系列低濃度頭孢噻呋標準品，其濃度分別為0.2、0.1、0.05、0.04、0.03 μg/g，每個濃度做5個平行樣品，按照上述樣品前處理步驟處理后進行檢測，以S/N=3時的最低藥物濃度作為該方法的檢測限，以S/N=10時的最低藥物濃度作為該方法的定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍與檢測限和定量限 目標物質(zhì)在0.05～10 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系，線性方程為y=87.545x+4123.6，相關系數(shù)r2為0.9998。按照信噪比為3時的最低濃度作為檢測限，信噪比為10時的最低濃度作為定量限，得到四種土壤的檢測限為30 μg/kg，定量限為50 μg/kg(圖1)。

圖1 頭孢噻呋標準曲線

2.2 方法的準確度和精密度 根據(jù)1.6.2項中的步驟得到回收率和日間變異系數(shù)作為方法的準確度和精密度，準確度范圍是70.8%～85.6%，日內(nèi)變異系數(shù)范圍是3.8%～9.8%，日間變異系數(shù)范圍是4.1%～10.6%，相應結(jié)果見表3。頭孢噻呋在四種土壤的添加色譜圖見圖2。

表3 四種土壤中頭孢噻呋的回收率、日內(nèi)和日間變異系數(shù)

圖2 壤土、黏土、砂壤土、砂土100 μg/L添加提取色譜圖(A:壤土B:黏土C:沙壤土D:砂土)

2.3 提取pH的選擇 本研究同時比較了不同pH緩沖液條件下的提取效果(磷酸鹽緩沖液pH=3、4、5、6、7以及硼酸鹽緩沖液pH=9、11)。根據(jù)結(jié)果pH=3、4、5、6、7時回收率最高只有60%左右,而pH=11時無法將頭孢噻呋提取出來，當pH=9時提取效果最好,回收率可達70%以上(圖3)。

圖3 不同提取pH條件的回收率

2.4 提取試劑的選擇 本研究除了硼酸緩沖液之外，還使用了pH為4的磷酸緩沖液乙腈不同比例混合提取液(V∶V=1∶1、1∶2、2∶1)、超純水、乙腈水(V∶V=4∶1)，結(jié)果表明，硼酸緩沖液能夠有效的將頭孢噻呋從土壤中提取出來且回收率最高。最終選擇pH=9的硼酸緩沖液作為提取試劑，各個提取試劑的回收率如圖4所示。

圖4 不同提取試劑的回收率

2.5 洗脫條件的選擇 同時對比了甲醇、乙腈、乙酸乙酯三種常用的洗脫試劑，結(jié)果表明甲醇的洗脫效果最好，而乙腈和乙酸乙酯無法將頭孢噻呋洗脫下來，檢測不到色譜峰，最終選擇甲醇作為最終的洗脫試劑。

3 討論與結(jié)論

3.1 提取試劑的選擇 對于土壤基質(zhì)來說，主要干擾檢測的因素為金屬離子和土壤的吸附能力，通過加入EDTA來有效的降低金屬離子對檢測的干擾，堿性緩沖液能夠更好的去除土壤對酸性藥物的吸附作用[18,13]。目前國內(nèi)外研究中，提取土壤中的獸用抗生素大多使用乙腈和緩沖液以一定比例混合作為提取試劑[19]，本實驗中也嘗試了此方法，但是提取的上清液均出現(xiàn)一定渾濁，并且回收率也比較低，原因可能是乙腈雖然具有較強的提取能力，但其會溶解土壤中的一些親脂性物質(zhì)，對分析造成干擾。在嘗試了幾種提取試劑后最終選取pH=9的硼酸緩沖液作為提取試劑。本文中黏土的回收率相較于其他三種土壤存在差異，黏土的有機質(zhì)含量明顯高于另外三種土壤，對于頭孢噻呋來說，其在這種土壤中吸附量更大，分子之間的吸附相較于另外幾種土壤不易破壞，因此，回收率會比另外三種土壤低一些，但也可以達到檢測要求。

3.2 提取pH條件的選擇 在不同提取pH條件下可以發(fā)現(xiàn)在pH=9使回收率達到70%以上，而pH在偏中性或者強堿性條件下回收率達不到要求，而強酸性條件下回收率可以達到60%以上但不如弱堿性環(huán)境回收率高，原因可能是酸性條件下無法破壞土壤和頭孢噻呋之間的吸附作用，堿性過強時由于頭孢噻呋本身pKa等于2.5～3.1，屬于強酸性藥物，在堿性較強(pH>11)的環(huán)境下相對不穩(wěn)定[4]，其會在很快的時間(幾小時)內(nèi)達到降解半衰期[20-22]。

3.3 洗脫條件的選擇 對于洗脫試劑來講，由于本實驗中使用的是HLB小柱，為親脂親水平衡柱，一般在洗脫時不需要調(diào)pH，三種洗脫試劑中甲醇的洗脫效果最好，可能是由于頭孢噻呋的極性與甲醇的極性相似，而乙酸乙酯和乙腈的極性均低于甲醇，無法將藥物完全洗脫下來，因此，最終選擇甲醇作為洗脫試劑。

本研究建立了一種高效液相色譜法檢測土壤中頭孢噻呋的方法，采用pH=9的硼酸緩沖液提取，經(jīng)HLB小柱凈化后進行分析。該方法專屬性較強、靈敏度高、重現(xiàn)性好、成本較低、回收率和精密度均可達到檢測要求，可以用來檢測四種土壤中的頭孢噻呋含量，為今后頭孢噻呋的環(huán)境行為研究提供了方法學借鑒。