液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)牛可食性組織中莫昔克丁的殘留

王亦琳，尹 暉，葉 妮，李 丹，孫 雷，王鶴佳

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

莫昔克丁(moxidectin)又稱莫西菌素，是由一種鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的半合成單一成分的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，是尼莫克丁(nemadectin)的乙酰胺化衍生物，屬于米爾貝霉素類(lèi)抗寄生蟲(chóng)藥物(Milbemycin)[1]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。莫昔克丁具有較高的脂溶性，在體內(nèi)主要分布于動(dòng)物肝臟和脂肪組織中，且在體內(nèi)殘留時(shí)間較長(zhǎng)。莫昔克丁相對(duì)于伊維菌素和阿維菌素有更廣的驅(qū)蟲(chóng)活性、長(zhǎng)效性和安全性等特性[2]。20世紀(jì)80年代中期，莫昔克丁開(kāi)始作為獸用驅(qū)蟲(chóng)藥使用。作為新一代驅(qū)蟲(chóng)藥物，莫昔克丁能夠高效的殺滅線蟲(chóng)和體表寄生蟲(chóng)，同時(shí)對(duì)動(dòng)物有很好的安全性，對(duì)皮膚無(wú)刺激性。目前，莫昔克丁是被廣泛用于獸醫(yī)臨床的廣譜、高效、新型抗寄生蟲(chóng)藥物。我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》[3]規(guī)定，莫昔克丁在牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組組織中的最高殘留限量(MRL)分別為20 μg/kg、100 μg/kg、50 μg/kg和500 μg/kg。

圖1 莫昔克丁化學(xué)結(jié)構(gòu)式

目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的動(dòng)物性食品中莫昔克丁的殘留檢測(cè)分析方法多為液相色譜-熒光檢測(cè)法[4-6]。這種方法有較高的選擇性和靈敏度，但在樣品前處理過(guò)程中需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)，步驟較為繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的樣品前處理步驟相對(duì)于液相色譜來(lái)說(shuō)一般較為簡(jiǎn)單快速，不需要衍生化的過(guò)程[7-9]。液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的三重四極桿技術(shù)具有多反應(yīng)監(jiān)測(cè)聯(lián)合信息依賴性采集與增強(qiáng)子離子掃描(MRM-IDA-EPI)檢測(cè)模式，能夠?qū)ξ粗衔镞M(jìn)行雙重定性，大大排除了假陽(yáng)性結(jié)果，提高了定性分析的準(zhǔn)確度。本文建立了一種液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜檢測(cè)方法，以滿足莫昔克丁在牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪等4種牛可食性組織中的殘留檢測(cè)要求。

1 材料與方法

1.1 儀器 日本島津公司Shimadzu 30A液相色譜儀-美國(guó)AB SCIEX公司Qtrap 6500質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)；AE260電子天平，Mettler Toledo公司；Biofuge Strators高速冷凍離心機(jī)，賀利氏公司；SIR4渦旋混合器，IKA公司；固相萃取裝置，Waters公司。

1.2 藥品和試劑 莫昔克丁對(duì)照品，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，含量≥94.0%；甲酸(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)，美國(guó)Fisher公司；C18固相萃取柱：300 mg/3 mL，美國(guó)Agilent公司；所用水為超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取莫昔克丁對(duì)照品約10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用乙腈溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；精密量取1 mg/mL的莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋成濃度為10 μg/mL的莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)工作液；精密量取10 μg/mL的莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)工作液1 mL于10 mL量瓶中，用50%乙腈水溶液溶解并稀釋成濃度為1 μg/mL的莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品的提取 稱取試料(2±0.02)g于50 mL離心管中，加乙腈6 mL，加入陶瓷均質(zhì)子，渦旋30 s混勻后，中速水平振蕩5 min，10000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一50 mL離心管中，加水10 mL，混勻，備用。

1.4.2 樣品的凈化與濃縮 C18固相萃取柱依次用乙腈5 mL和30%乙腈水溶液5 mL活化，取備用液8 mL過(guò)柱，用30%乙腈水溶液5 mL淋洗，抽干，用乙腈5 mL洗脫，收集洗脫液于10 mL試管中，于50 ℃水浴氮?dú)獯蹈伞Ｓ?0%乙腈水溶液1.0 mL充分溶解殘余物后過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜測(cè)定。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18(50 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm)，流動(dòng)相A相為0.1%甲酸水溶液；B相為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫：0～1 min保持75% B；1～3 min，75% B線性變化到95% B；3～4.5 min保持95% B；4.6～6 min保持75% B；流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)；電噴霧電壓為5500 V；離子源溫度為550 ℃；輔助氣1為55 psi；輔助氣2為55 psi；氣簾氣為30 psi；碰撞氣為High；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)聯(lián)合信息依賴性采集與增強(qiáng)子離子掃描模式(MRM-IDA-EPI)。莫昔克丁定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的去簇電壓、碰撞能量見(jiàn)表1。IDA參數(shù)：①使用動(dòng)態(tài)背景扣除功能；②從不排除之前的目標(biāo)離子；③觸發(fā)閾值：100 cps。EPI參數(shù)：①掃描范圍：m/z100～650；②掃描速度：10000 Da/s；③CE：35 ev；CES：15 ev。

表1 莫昔克丁MRM參數(shù)

1.6 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取適宜濃度的莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用50%乙腈水溶液稀釋成濃度為1、2、5、10、20、50和100 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液(適用于牛肌肉和腎臟)；或1、2、5、10、20、50、100和200 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液(適用于牛肝臟)；或1、2、5、20、100、200、500和1000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液(適用于牛脂肪)，從中各取1.0 mL，分別加入到空白試料經(jīng)提取、凈化和吹干后的殘余物中，充分溶解，過(guò)微孔濾膜后作為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.7 方法準(zhǔn)確度及精密度的測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中添加定量限、MRL、2MRL三個(gè)濃度的莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)工作液。每種濃度5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，按照1.4樣品前處理方法處理之后上機(jī)測(cè)定，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量，計(jì)算回收率、批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

1.8 方法靈敏度確定 添加適量濃度的莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)工作液于2 g空白牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織中，經(jīng)前處理后測(cè)定，觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N)和對(duì)應(yīng)藥物濃度，以 S/N>10(按PtP算)作為方法的定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析 在日常的MRM檢測(cè)模式中，通常選擇一個(gè)母離子和兩個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的子離子進(jìn)行定性分析。但在殘留檢測(cè)的實(shí)際工作中，由于待測(cè)樣品通常為各種動(dòng)物組織樣品，基質(zhì)比較復(fù)雜，盡管通過(guò)樣品前處理進(jìn)行了凈化操作，檢測(cè)中仍會(huì)出現(xiàn)基質(zhì)干擾峰，影響定性和定量的準(zhǔn)確性。本研究采用MRM-IDA-EPI檢測(cè)模式，可以在利用MRM精確定量的同時(shí)，得到目標(biāo)子離子的二級(jí)子離子全掃描質(zhì)譜圖(EPI圖)，通過(guò)與對(duì)照溶液的EPI圖進(jìn)行對(duì)比，可以更為準(zhǔn)確地做出定性判斷。圖2是莫昔克丁陽(yáng)性添加樣品和對(duì)照溶液的EPI圖對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)兩者的特征子離子匹配度較高，呈現(xiàn)出子離子“指紋圖”的效果。按照一個(gè)母離子1個(gè)識(shí)別點(diǎn)(IP)點(diǎn)，一個(gè)子離子1.5個(gè)IP點(diǎn)計(jì)算，圖2中主要有7個(gè)特征子離子，共11.5個(gè)IP點(diǎn)，超出歐盟2002/657/EC[10]規(guī)定的至少3個(gè)IP點(diǎn)的要求，進(jìn)一步提高了生物樣本復(fù)雜基質(zhì)中定性的準(zhǔn)確性。

1.莫昔克丁空白牛肝添加樣品；2.莫昔克丁對(duì)照溶液

2.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線 以莫昔克丁的特征離子質(zhì)量色譜峰面積與其對(duì)應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作圖，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2)見(jiàn)表2。莫昔克丁在牛肌肉和牛腎臟1～100 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi)；在牛肝臟1～200 ng/mL的濃度范圍內(nèi)和在牛脂肪1～1000 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi)，特征離子質(zhì)量色譜峰面積與濃度均呈良好的線性關(guān)系，R2均>0.990。

表2 莫昔克丁基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.3 方法靈敏度 按1.8中所述方法進(jìn)行處理，依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N>10為方法的定量限，得出在空白牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織中，莫昔克丁的定量限均為2 μg/kg。2 μg/kg空白牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織添加樣品中莫昔克丁的特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖3。

1.牛肌肉；2.牛肝臟；3.牛腎臟；4.牛脂肪

2.4 方法準(zhǔn)確度及精密度 在空白牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中各添加3個(gè)不同濃度的莫昔克丁標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果匯總見(jiàn)表3，莫昔克丁在牛肌肉2～40 μg/kg、牛肝臟2～200 μg/kg、牛腎臟2～100 μg/kg和牛脂肪2～1000 μg/kg添加濃度水平上的回收率在65.6%～115%范圍內(nèi)；批內(nèi)與批間RSD均小于15%。結(jié)果表明本方法定量準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

表3 空白牛可食性組織中莫昔克丁添加的回收率(n=5)

3 討論與結(jié)論

3.1 樣品前處理方法的建立 通過(guò)大量查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，試驗(yàn)中最先參考已報(bào)道的幾個(gè)QuEChERS前處理方法[11-12]：使用乙腈提取，MgSO4除水，PSA粉末凈化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種方法處理牛肉回收率較好，但處理牛肝回收率較低，且譜圖中有很多干擾的雜峰，說(shuō)明該方法對(duì)牛肝這種基質(zhì)更為復(fù)雜的樣品凈化效果不佳。考慮到莫昔克丁分子結(jié)構(gòu)的母核與阿維菌素和多拉菌素有相似之處[13]，又參考了阿維菌素和多拉菌素的前處理方法[14-15]：乙腈提取后加水稀釋?zhuān)萌野氛{(diào)節(jié)pH值，經(jīng)C18固相萃取柱凈化。但是在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取液中加入三乙胺時(shí)，會(huì)明顯降低方法的回收率，因此不使用三乙胺。同時(shí)我們也考察了C18柱對(duì)莫昔克丁的保留效果和不同濃度的乙腈水溶液的淋洗效果，最終確定了用30%乙腈水溶液淋洗，可以在有效去除樣品中極性雜質(zhì)的同時(shí)，不會(huì)將莫昔克丁藥物洗脫造成回收率損失。考慮到過(guò)柱的時(shí)間因素，將提取溶液的一半進(jìn)行過(guò)柱，能夠較為有效的去除雜質(zhì)，同時(shí)減少一半的基質(zhì)影響，最后定容體積也采用了1.0 mL的體積，而不是濃縮的0.5 mL體積，降低了氮?dú)獯蹈珊鬂饪s步驟的影響。

3.2 質(zhì)譜條件的建立和定性方法的選擇 由于本文的分析對(duì)象牛肌肉、肝臟、腎臟、脂肪均屬于動(dòng)物源性樣品，基質(zhì)比較復(fù)雜，在使用一般的MRM方法進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)，目標(biāo)分析物容易受到復(fù)雜基質(zhì)的干擾影響。樣品中定性離子對(duì)豐度比與對(duì)照溶液相比，容許偏差易超出歐盟2002/657/EC[10]中的規(guī)定，影響定性的準(zhǔn)確性。因此我們建立了MRM-IDA-EPI的質(zhì)譜分析方法。首先使用針泵進(jìn)樣，在正離子模式下進(jìn)行Q1掃描，找到準(zhǔn)分子離子峰。之后對(duì)準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行子離子掃描，選擇相應(yīng)值最強(qiáng)且穩(wěn)定的兩個(gè)子離子分別作為定量離子和定性離子，并進(jìn)一步優(yōu)化MRM各項(xiàng)參數(shù)。接著我們利用儀器的線性離子阱(Trap)功能在第三重四極桿處(Q3)進(jìn)行二級(jí)子離子的富集掃描[16-17]。使用動(dòng)態(tài)背景扣除功能，并將閾值設(shè)為100 cps。在掃描過(guò)程中當(dāng)MRM通道采集的信號(hào)超過(guò)100 cps時(shí)就會(huì)觸發(fā)EPI增強(qiáng)子離子掃描。CE和CES分別設(shè)為35 ev和15 ev，可以同時(shí)得到20、35和50 ev三個(gè)碰撞能量水平下的子離子質(zhì)譜圖，獲得更為全面的質(zhì)譜信息。該檢測(cè)方法在使用MRM定量的同時(shí)，可以得到目標(biāo)子離子的二級(jí)質(zhì)譜全掃描圖。在實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，可將樣品與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的二級(jí)子離子圖進(jìn)行對(duì)比，比較兩者的特征離子的分布及強(qiáng)度，進(jìn)而做出更為準(zhǔn)確地判斷。該方法豐富了樣品定性所需要的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，提高了方法的選擇性[18]。

3.3 定量方法的選擇 該方法針對(duì)牛肌肉、肝臟、腎臟、脂肪，在進(jìn)行前處理后上機(jī)測(cè)試發(fā)現(xiàn)均存在一定的基質(zhì)效應(yīng)。因此在定量方法選擇時(shí)采用了基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法進(jìn)行定量，可以有效消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高方法定量的準(zhǔn)確性。

本文采用液相色譜-三重四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜技術(shù)建立了一種可檢測(cè)牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中莫昔克丁殘留的分析方法。該方法在進(jìn)行常規(guī)的MRM采集同時(shí)，采用IDA-EPI模式又可以獲得目標(biāo)分析物子離子的完整二級(jí)質(zhì)譜信息，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了定性和定量，可以有效防止假陽(yáng)性的產(chǎn)生。同時(shí)該方法具有良好的可操作性和重現(xiàn)性，方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。