動物源食品中氨曲南殘留檢測方法的建立

閻玉林，王世永，陳 玲，李桂華，章安源，李冬曉，張蘇蘇

(1.青島譜尼測試有限公司，山東青島 266100；2.福州市海洋與漁業技術中心，福州 350007；3.山東省獸藥質量檢驗所，濟南250010；4.山東省飼料質量檢驗所，濟南 250010)

氨曲南(aztreonam)是第一個應用于臨床的單環β-內酰胺類抗生素，常作為氨基糖苷類藥物的替代品，用于治療腎功能損害患者的需氧革蘭氏陰性菌感染；也可在密切觀察情況下用于對青霉素、頭孢菌素過敏的患者[1-3]。根據農業農村部《2018年獸醫工作要點》的要求，獸用抗生素的監控將越來越嚴格。從耐藥性上考慮，將氨曲南列為12類不宜被批準使用的獸藥抗生素。

目前，國內外關于氨曲南檢測的研究主要集中在兩方面，一是對于氨曲南原藥及其副產物的研究[4-7]；二是研究氨曲南在人體血液和尿等組織中的代謝規律[8-10]。而動物源食品中氨曲南的測定鮮有報道。本試驗針對動物源食品基質復雜，樣品前處理繁復、不易檢測等問題，采用磷酸鹽緩沖溶液提取，固相萃取柱凈化樣品，建立了一種液相色譜串聯質譜測定動物源食品中的氨曲南殘留量的方法，有效解決了動物源食品中氨曲南不易測定的難題，彌補了該項工作的空白。方法的建立將對打擊違法濫用藥物，保障動物源性食品質量安全具有重要的科學意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 Waters Xevo TQ-S micro液質聯用儀(Waters公司)；JY3002電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；XW-80A旋渦混合器(上海精科實業有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；IKA T18 basic組織勻漿機(德國IKA)。

氨曲南，批號130507-201303，純度96.9%，購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈(色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)、甲酸(純度98%，北京百靈威科技有限公司)；磷酸二氫鈉、氫氧化鈉(分析純，青島合力興化玻有限公司)；一級水(電阻率≥18 MΩ·cm)；固相萃取柱：SBEQ-CA6685 CNW Poly-Sery HLB Pro SPE，(200 mg，6 mL)(上海安譜實驗科技股份有限公司)，0.22 μm疏水型PTFE聚四氟乙烯微孔濾膜(天津領航實驗設備股份有限公司)，高純氮、高純氬(純度均為99.999%，青島長松氣體有限公司)。

1.2 標準溶液的配制 準確稱取適量氨曲南標準品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇配制成標準儲備液(1000 μg/mL)，避光儲存于冰箱中(-18 ℃)備用，有效期3個月。

1.3 儀器條件 Agilent SB-AQ(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相A：0.1%甲酸水溶液，B相：甲醇，梯度洗脫條件：20% B保持0.5 min，在1.0 min內線性增至50% B，保持0.5 min，在0.3 min內線性增至80% B，保持1 min，在0.5 min內線性增至95% B，保持1 min，然后降至20% B，保持1 min; 流速: 0.35 mL/min；進樣量:5 μL；柱溫:30 ℃。

質譜條件：ESI源負離子模式電離；反應監測(MRM)；毛細管電壓：2.4 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；脫溶劑氣溫度：500 ℃：錐孔氣流速：50 L/h；二級碰撞氣：氬氣。定量離子對為m/z=434.06/95.94，定性離子對為m/z=434.06/121.81，錐孔電壓為20 V，碰撞能量分別為20 eV和30 eV。

1.4 樣品前處理 稱取(5.00±0.05)g樣品，置于50 mL玻璃離心管內，加10 mL 0.15 mol/L磷酸二氫鈉(pH=7.0)提取液，勻漿1 min，提取15 min，8000 r/min離心5 min，將上清液轉移到新的離心管中，剩余殘渣重復提取，再加入10 mL提取液，重復提取一遍，合并提取液，作為備用液。

HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇，5 mL水和5 mL 0.15 mol/L磷酸二氫鈉(pH=7.0)活化，取10 mL備用液過固相萃取柱，用5 mL 水淋洗，然后用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40 ℃氮吹至近干。加2 mL 0.1%甲酸甲醇/水溶液(50∶50，v/v)復溶，充分渦旋混勻，8000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm有機濾膜后，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

2 結果與分析

2.1 線性考察 質譜定量結果的準確性受基質的影響，在沒有內標的情況下一般需要配制基質標曲，取空白樣品(檢測結果為陰性的雞肉、雞蛋、雞肝、豬肉、魚肉)按照1.4進行處理，得到空白基質溶液，用空白基質溶液配制成1、2、5、10、20 ng/mL的氨曲南標準工作液, 以待測物的濃度為橫坐標, 色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線,其線性相關系數(R2)均大于0.995，詳細數據見表1，說明在1～20 ng/mL的標準曲線范圍內，線性良好。

表1 不同動物組織中添加氨曲南的標準曲線

2.2 方法的檢出限和定量限 檢出限和定量限采用空白組織(檢測結果為陰性的雞肉、雞蛋、雞肝、豬肉、魚肉)中添加氨曲南的方法，按照1.4的方法處理樣品進行測定，經實驗得到特征離子色譜峰信噪比大于或等于3(S/N≥3)的最低濃度為1.0 μg/kg，即方法的檢出限，信噪比大于或等于10(S/N≥10)且回收率和精密度較好的濃度為2.0 μg/kg，即方法的定量限。

2.3 方法的準確度與精密度 在空白雞肉樣品(檢測結果為陰性的樣品)中添加2.0、4.0、10.0 μg/kg的氨曲南進行加標回收率實驗，各添加水平進行6個樣品的平行試驗，測得氨曲南的準確度和精密度，空白雞肉樣品添加氨曲南后得到的特征離子質量色譜圖如圖1所示。本方法同時考察了雞蛋、雞肝、豬肉、魚肉等動物性食品中氨曲南適用性，數據顯示本方法在空白加標樣品中的回收率為70 %～110 %，批內和批間相對標準偏差(RSD)均未超過10 %，說明重現性良好，該方法比較穩定，數據詳見表2。

表2 方法的準確度和精密度(n=6)

圖1 空白雞肉中添加2.0 μg/kg氨曲南的特征離子質量色譜圖

3 討論與結論

3.1 流動相的優化 試驗考察了5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈，5 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇，0.1%甲酸水溶液-甲醇，0.1%甲酸水溶液-乙腈和水-甲醇等5種流動相體系對分析效果的影響。當采用0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相時，目標物色譜峰對稱性好，響應強度高，保留時間和色譜峰面積重復性好，因此選擇0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相。氨曲南標準品的總離子流圖見圖2。

圖2 氨曲南的總離子流圖

3.2 提取條件的選擇 參考文獻報道的關于β-內酰胺類抗生素的實驗條件[11-15]，通常采用乙腈、乙腈/水溶液(15∶2，v/v)、乙腈/水溶液(80∶20，v/v)、0.15mol/L磷酸二氫鈉(pH=8.5)、0.15mol/L磷酸二氫鈉(pH=7.0)和0.15mol/L磷酸二氫鈉(pH=5.0)，經過陰性樣品添加，通過回收率來選擇最佳的提取條件。結果顯示，含乙腈的提取液回收率均低于10%，分析原因可能是氨曲南微溶于乙腈溶液導致；另外一個原因是采用含乙腈的提取液整個過程繁瑣，容易導致目標化合物降解或損失。β-內酰胺類抗生素以磷酸鹽緩沖液作為提取液的檢測方法，大都選擇pH保持在8.0～9.0，而實驗結果表明，氨曲南在中性條件下穩定，因此本實驗選擇0.15mol/L磷酸二氫鈉(pH=7.0)作為提取液。

實驗也考察了提取液用量、提取方法和提取次數對提取效果的影響，經過優化，當稱樣量為5.00 g時，用10 mL 0.15 mol/L磷酸二氫鈉(pH=7.0)，提取兩次為最佳，平均回收率可以達到80%左右。同時考慮提取液用量過大，會增加后續凈化濃縮等步驟的難度，且不利于環保。對于實驗室常用的提取方法，超聲提取和震蕩提取對于氨曲南的回收率基本相同，不同提取方法對回收率的影響不大。

3.3 固相萃取柱的選擇 實驗主要是針對動物源食品，基質復雜，而且是采用磷酸鹽緩沖溶液提取，為了達到更好的富集和凈化效果，因此需要增加凈化處理步驟。實驗主要考察了常用的MAX，C18和HLB三種不同極性的固相萃取柱。配制濃度為10 ng/mL的氨曲南磷酸鹽緩沖溶液，通過直接過固相萃取柱凈化的方式考察其回收率。結果顯示：MAX和C18固相萃取柱對氨曲南不保留，回收率接近為0，而HLB固相萃取柱的凈化效果好，平均回收率在80%左右，因此實驗選擇HLB固相萃取柱對樣品做進一步的凈化處理。

3.4 定容液的確定 實驗對比了水，甲醇，乙腈，乙腈/水溶液(50∶50，v/v)，乙腈/水溶液(20∶80，v/v)，甲醇/水溶液(50∶50，v/v)和0.1%甲酸甲醇/水溶液(50∶50，v/v)等7種不同的定容液，實驗結果顯示，含乙腈的定容液氨曲南出兩個峰，峰型差，因此不建議使用含乙腈的溶液作為定容液。當采用0.1%甲酸甲醇/水溶液(50∶50，v/v)作為定容液時，氨曲南的響應最高，因此本實驗選用0.1%甲酸甲醇/水溶液(50∶50，v/v)作為定容液。

3.5 基質效應實驗結果 基質效應是影響定量分析結果準確性的重要因素，實驗通過比較溶劑標準溶液和基質標準溶液響應值來評價基質效應的影響。

溶劑標準溶液：將1000 μg/mL的標準溶液(1.2)用0.1%甲酸甲醇/水溶液(50∶50，v/v)稀釋至5 ng/mL，得溶劑標準溶液。

基質標準溶液：稱取(5.00±0.05)g空白組織(雞肉、雞蛋、雞肝、豬肉和魚肉)各5份，按1.4項方法處理后獲得相應組織空白基質溶液，取適量標準品工作溶液將其稀釋至5 ng/mL，得基質標準溶液。

將5 ng/mL的溶劑標準溶液和基質標準溶液按1.3項的儀器條件進樣測試，所得峰面積均值和RSD如表3所示。實驗結果表明，不同動物源組織的基質標準溶液與溶劑標準溶液相比，均存在不同程度的基質抑制作用，因此本方法采用基質標準曲線進行定量校正。

表3 不同動物組織中檢測氨曲南的基質效應研究

3.6 結論 試驗采用磷酸鹽緩沖溶液作為提取液, 經過固相萃取柱凈化, 液相色譜串聯質譜法檢測, 基質匹配標準曲線法定量。該方法樣品前處理簡單、耗時短、有機溶劑用量少, 而且測試數據重復性好, 回收率高, 精密度和準確度均能滿足食品理化分析的要求, 適用于雞肉、雞蛋、雞肝、豬肉和魚肉等動物源性食品中氨曲南的日常檢測，也可為其它動物組織中氨曲南的測定提供參考。