單一和聯(lián)合狂犬疫弱毒苗制劑給藥后家兔血漿中吡喹酮的含量及血藥濃度研究

蘇日娜，木 蘭，牧 丹，于晶峰*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 呼和浩特 010100；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 呼和浩特 010100)

吡喹酮(Praziquantel,PZQ)是由德國拜爾公司和E-Merck公司研究成功的于20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來一種新型的廣譜抗寄生蟲病藥物[1]。臨床應(yīng)用表明，吡喹酮為理想的新型抗吸蟲和絳蟲藥物，對吸蟲病和絳蟲病的治療效果良好，已成為治療吸蟲病和絳蟲病的首選藥物[2-4]。目前血吸蟲病的治療仍然依賴于吡喹酮單一療法。盡管吡喹酮可有效殺滅血吸蟲成蟲，但對感染相關(guān)的病理損害無效，由于吡喹酮耐藥蟲株的出現(xiàn)，尋求可替代的抗血吸蟲病藥物成為研究焦點。近年來臨床前研究和試驗發(fā)現(xiàn)，吡喹酮與多種抗瘧[5]、抗炎藥[6]、抗纖維化[7]、抗氧化劑[8]等輔助藥物聯(lián)合應(yīng)用顯示出良好的殺蟲效果。在治療過程中，如果聯(lián)合阿維菌素類抗線蟲藥物，可使吡喹酮的抗寄生蟲譜進一步擴大，對蠕蟲病也可起到一定的治療效果。同時有研究顯示[9]，在對片形吸蟲病的治療中，三氯苯噠唑起到了較好的治療效果，而吡喹酮卻無效，如果將二者聯(lián)合使用，則對所有吸蟲病和絳蟲病均可起到一定療效。郭冬梅等[10]將吡喹酮、阿苯達(dá)唑兩種藥品聯(lián)合用于治療人腦實質(zhì)型腦囊尾坳病，在相同的治療時間內(nèi)，聯(lián)合用藥與單獨用藥治療比較取得了更好的療效，并療程明顯縮短。Homeida[11-12]等對吡喹酮與阿苯噠唑互相影響的藥代動力學(xué)進行了研究，結(jié)果表明，吡喹酮的藥代動力學(xué)參數(shù)并沒有因為同時服用阿苯噠唑而受到影響，二者的半衰期改變不明顯，聯(lián)合用藥后，不僅提高了療效、縮短了療程，且安全性高，無明顯的毒副作用。在前期研制了細(xì)粒棘球絳蟲驅(qū)蟲藥——吡喹酮與狂犬弱毒疫苗的復(fù)合制劑[13],確定了含藥家兔血漿的前處理方法[14]的基礎(chǔ)上，本實驗建立了家兔血漿樣品中吡喹酮的HPLC測定方法，測定單獨和聯(lián)合狂犬弱毒疫苗制劑給藥后家兔血漿中吡喹酮的含量，繪制兩種不同給藥后吡喹酮的血藥濃度-時間曲線，并初步研究其藥代動力學(xué)特征參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 健康成年家兔15只，常規(guī)飼養(yǎng)。空腹12 h后耳廓靜脈采血。家兔血漿用肝素鈉抗凝管收集采集的血液，3500 r/min離心10 min后，收集血漿，-20 ℃保存。

1.1.2 試驗儀器 電子天平(BS 224 S)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；高效液相色譜儀(LC-2010A HT)，日本島津公司；離心機(3-30K)，德國Sigma公司；渦動器(GL-88B)，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；真空泵(SHB-III)，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；12孔氮吹儀(PGC-01D)，北京晨曦科創(chuàng)科技有限公司。

1.1.3 試劑 乙腈、甲醇(色譜純，sigma公司)，吡喹酮對照品(色譜純，sigma公司，批號10129462)，狂犬病活疫苗(Flury株，瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，批號：13021)。吡喹酮原粉，新開元動物制藥有限公司提供；7%吡喹酮注射劑，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲學(xué)實驗室制備。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Discovery C18(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈/水(A/B)等濃度洗脫，即0.01～30.00 min，A/B=43/57；檢測波長330 nm；流速1 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。流速1.0 mL/min；檢測波長263 nm；柱溫35 ℃；進樣量20 μL。

1.2.2 對照品溶液配制 精密稱取吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成濃度為12 μg/mL吡喹酮對照品溶液。

1.3 體外家兔血漿樣品中喹諾酮的HPLC方法學(xué)確證

1.3.1 血漿樣品處理方法 吸取1 mL血漿樣品于10 mL離心管，加3 mL乙酸乙酯，漩渦8 min后，8000 r/min離心10 min，吸取乙酸乙酯層于另一試管中。重復(fù)提取一次，中和兩次乙酸乙酯層，于50 ℃下氮氣揮干。殘渣中加入甲醇 0.4 mL渦流振蕩溶解，8000 r/min 離心 5 min，取上清液 20 μL 進樣。

1.3.2 方法專屬性考察 按上述血漿處理方法處理含藥生物樣品和空白生物樣品后，進樣 20 μL，用上述HPLC方法測定。

1.3.3 體外家兔血漿中喹諾酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取家兔空白血漿6份1.0 mL，分別加入吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其血漿中吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為2、4、6、8、12、16 μg/mL，渦流振蕩混勻，按血漿樣品處理方法操作，吸取 20 μL，用上述HPLC條件測定，每個濃度下設(shè)3個重復(fù)，根據(jù)吡喹酮峰面積平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取家兔空白血漿1.0 mL，加入吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，按血漿樣品預(yù)處理方法操作，吸取20 μL上清液，用上述HPLC條件測定。進樣時間分別在0、2、4、8、12、24 h。記錄每次進樣后吡喹酮的峰面積，采用不同時間進樣的喹諾酮的峰面積或峰高的RSD%計算穩(wěn)定性。

1.3.5 重復(fù)性試驗 精密吸取家兔空白血漿6份各1.0 mL，加入吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，按血漿樣品處理方法操作，吸取20 μL上清液，用上述HPLC 條件測定，記錄每次進樣后吡喹酮的峰面積，采用峰面積或峰高的RSD%計算重復(fù)性。

1.3.6 回收率試驗 配制兩種標(biāo)準(zhǔn)濃度(120、90 μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)品樣品。用HPLC進行檢測，求算出各濃度吡喹酮峰面積。算出各濃度吡喹酮的峰面積與相對應(yīng)濃度的吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的比值，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，此比值為待考察樣品的絕對回收率。

1.4 單獨給藥及聯(lián)合給藥后家兔血漿中吡喹酮的含量測定 健康成年家兔15只，常規(guī)飼養(yǎng)。實驗組分為對照組(生理鹽水)、7%吡喹酮注射劑組以及狂犬疫苗-吡喹酮復(fù)合制劑組，每組5只。實驗組根據(jù)犬與家兔的體表面積-劑量換算公式，換算成等價藥物劑量，注射用水稀釋，稀釋后體積為0.5 mL，空腹12 h后肌注。在給藥后不同時間點耳廓靜脈采血。用肝素鈉抗凝管收集采集的血液，3500 r/min離心10 min后，收集血漿，-20 ℃保存。同上采用血漿樣品處理方法，取上清液用HPLC方法測定各實驗組中吡喹酮的含量，進行統(tǒng)計學(xué)處理，繪制單獨和聯(lián)合給藥后家兔血漿中吡喹酮的血藥-濃度曲線。

像其他寄生蟲一樣，弓形蟲可以在動物和人之間傳染，其主要傳播途徑是消化道。人食用被感染的肉類或接觸被感染貓的糞便，直接或間接通過胃腸道感染弓形蟲。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性 結(jié)果如圖1、圖2所示。由圖1、圖2可以看出，空白血漿中未檢測到吡喹酮，而單一給藥后血漿中能夠明顯的檢測到吡喹酮的存在。在該方法中，吡喹酮峰保留時間在15.10 min左右、無雜峰干擾，且拖尾因子和塔板數(shù)均符合要求。

圖1 空白血漿色譜圖

圖2 單獨給藥血漿樣品色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在上述色譜條件下，吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品在2～16 μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，直線回歸方程為y=127874x-4658.6(R2=0.9996，n=6)。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 穩(wěn)定性結(jié)果 穩(wěn)定性結(jié)果見表1。由表1可知，該方法在0～24 h內(nèi)穩(wěn)定性很好，可以用于吡喹酮的定性及定量檢測。

表1 家兔血漿中吡喹酮的穩(wěn)定性結(jié)果

2.4 重復(fù)性結(jié)果 重復(fù)性結(jié)果見表2。由表2可知，該方法的重復(fù)性良好，可以用于吡喹酮的定性及定量檢測。

表2 家兔血漿中吡喹酮的重復(fù)性結(jié)果

2.5 回收率結(jié)果 回收率結(jié)果見表3。通過峰面積測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的計算，平均回收率為86.79%。

表3 家兔血漿中吡喹酮的回收率結(jié)果

2.6 單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮含量變化 從表4可以看出，單獨給藥后，血漿中吡喹酮的含量在15 min后迅速增加，在1 h達(dá)到峰值，在4 h時含量達(dá)到低值，此后代謝緩慢，在24 h后仍能檢測到微量吡喹酮，此時的吡喹酮幾乎完全代謝。

表4 單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的含量

由圖4可以看出，單獨給藥與聯(lián)合給藥后血漿中吡喹酮含量的變化趨勢幾乎完全相同，聯(lián)合給藥后血漿中的吡喹酮含量峰值較單獨給藥的要高，可見聯(lián)合給藥比單獨給藥可能更有助于吡喹酮的吸收代謝。

圖4 單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的血藥濃度曲線

通過DAS3.1.1藥代動力學(xué)軟件統(tǒng)計計算后，單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的非房室模型的參數(shù)如表5所示,單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的藥峰濃度(Cmax)分別為1.163±0.013 μg/L和1.485±1.232 μg/L，聯(lián)合給藥的略高于單獨給藥。單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的藥時曲線下面積(AUC0-t)的分別為2.043±0.025 μg/L·h和2.068±0.279 μg/L·h，聯(lián)合給藥的略高于單獨給藥。單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的平均駐留時間(MRT(0-t))分別為3.976±0.423 h和3.735±0.398 h，單獨給藥的略高于聯(lián)合給藥。單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的清除率(CL)基本相同。以上結(jié)果表明，單獨給藥與聯(lián)合給藥后血漿中吡喹酮的藥代動力學(xué)參數(shù)基本相同，但是Cmax和AUC聯(lián)合給藥比單獨給藥略微高一點，而MRT稍低一些，可能說明聯(lián)合給藥比單獨給藥更有助于吡喹酮的吸收代謝。

表5 單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的藥代動力學(xué)參數(shù)

3 討論與結(jié)論

在本研究中，通過單獨給藥和聯(lián)合給藥后測定血藥濃度，發(fā)現(xiàn)血漿中吡喹酮含量的變化趨勢呈現(xiàn)相似的情形，在15 min后迅速增加，在1 h達(dá)到峰值，在4 h含量達(dá)到低值，此后代謝緩慢，在24 h仍能檢測到微量吡喹酮，此時的吡喹酮從體內(nèi)幾乎代謝完全。聯(lián)合給藥后血漿中的吡喹酮含量峰值較單獨給藥的藥物含量高少許，可見聯(lián)合給藥比單獨給藥可能更有助于吡喹酮的吸收代謝。藥代動力學(xué)參數(shù)計算結(jié)果與此結(jié)果相符。

實驗中發(fā)現(xiàn)，吡喹酮含量峰值的時間與武杰較為一致，與操繼躍[15]和賈冬舒[2]研究結(jié)果有些差異，本實驗的血漿吡喹酮峰值時間有所提前，這可能與實驗動物的種類、給藥方式及給藥濃度有關(guān)。何坎[16]研究了左旋和右旋吡喹酮在人體和大鼠肝微粒體的代謝，得出吡喹酮對應(yīng)異構(gòu)體在人和大鼠肝微粒體代謝有著嚴(yán)格的立體選擇，為完善本實驗提供了新的方向。對于吡喹酮不同的異構(gòu)體與狂犬疫苗的聯(lián)合代謝方面，是否也存在著立體選擇有待進一步研究。

在聯(lián)合給藥方面，未見吡喹酮和狂犬疫苗聯(lián)合給藥的文獻(xiàn)報道，本文就單獨給藥和聯(lián)合狂犬疫弱毒苗制劑后家兔血漿中吡喹酮的藥代動力學(xué)過程對體內(nèi)藥物吸收和代謝過程進行初步研究，以期為臨床安全合理給藥提供參考，同時為實際應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。