大蒜素及納豆菌對福建白兔生產性能、抗氧化活性、腸道形態及菌群的影響

陳冬金，王錦祥，孫世坤，陳敏卿，桑 雷，陳巖鋒，高承芳，謝喜平 *

（1. 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建 福州 350013；2. 龍巖市農業農村局，福建 龍巖 364000）

0 引言

【研究意義】近年來，兔肉作為“三高三低”的保健肉，越來越受到人們的青睞，其消費市場逐漸拓展，市場潛力大。福建白兔屬小型肉用地方兔，2014年通過了國家畜禽遺傳資源專家委員會認定[1]，2015年列入福建省畜禽遺傳資源保護名錄和中國畜禽遺傳資源志，其全身披白色毛，具有適應性廣、繁殖性能好、肉質優異等優點[2]，是中國地方優良兔品種。與大種肉兔相比，其肌肉營養成分高（肌肉粗蛋白含量高），肉質鮮嫩（肌纖維面積小，肌內脂肪含量高）[3?4]。福建白兔耐粗飼、易飼養、價格高，近年來該品種受到農業農村部和福建省農業部門的重視，福建白兔的養殖戶和養殖企業逐漸增多，養殖量不斷增多，但其飼養方式主要是采取限制飼養。自由采食，幼兔消化道疾病發生率和死亡率高，適宜的家兔飼料添加劑可以讓家兔自由采食的同時保證較高的成活率?！厩叭搜芯窟M展】大蒜素（Allicin）是以大蒜鱗莖為原料提取的產品，也可化工合成。動物飼料中使用的大蒜素一般是由合成的大蒜油為原料制成的預混料，具有清除自由基和抗氧化[5]、增強機體免疫力[6]等功能，可改善飼料的適口性、提高采食量、促進動物生長發育、提高生產性能[7]、減少動物患病率[8]，倍受養殖行業的青睞。納豆芽孢桿菌（Bacillus natto，BN），屬枯草芽孢桿菌納豆菌亞種，革蘭陽性菌，只具有單層細胞外膜，是一類好氧型、內生抗逆孢子的桿狀細菌，具有廣譜抗菌活性[9]和極強的抗逆能力[10]；可以調節腸道菌群，增強動物細胞免疫反應[11]，并能生成多種蛋白酶、糖化酶、脂肪酶等，降解植物性飼料中的碳水化合物，提高飼料的轉化率。陳兵等[12]研究發現日糧中添加200 mg·kg?1的納豆芽孢桿菌可以提高肉雞的平均日增重、日采食量。在推行無抗飼養的大環境下，納豆菌作為益生菌既能提高動物免疫力，又不會出現耐藥性等不利影響，是環境友好型飼料添加劑。納豆菌在豬[13]、羊[14]、牛[15]上作為飼料添加劑使用的案例均有研究報道。大蒜素能抑制有害菌，且對益生菌如干酪乳桿菌有促進作用，這是大蒜既能防病治病，又能夠促進食欲、幫助消化的重要原因[16]。丁酸梭菌與大蒜素同用，對青腳麻雞具有顯著的生長促進作用[17]。【本研究切入點】大蒜素和納豆菌作為動物飼料添加劑，兩者均可提高采食量、降低發病率、促進生長和改善飼養環境，目前關于二者聯合使用在肉兔中的飼養效果未見報道。大蒜素既可提高食欲，又可抑制有害菌、促進有益菌（如納豆菌）的生長，兩者聯合使用，可能有協同作用?！緮M解決的關鍵問題】本試驗通過研究大蒜素、納豆菌及其復合物對福建白兔生長性能、抗氧化活性、腸道形態和菌群的影響，旨在為肉兔生產中合理開發利用無抗飼料添加劑，且為開發適用于肉兔自由采食飼喂方式的飼料提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物為健康的福建白兔（40 日齡，公母各半），35 日齡時購自武平縣武東鄉袁田村福建白兔生態養殖場，暫養5 d 后開始試驗。大蒜素購自濰坊加易加生物科技有限公司，大蒜素含量25%；納豆芽孢桿菌凍干粉購自福建盛德實業有限公司，含量為3.5×108CFU·g?1。

1.2 試驗方法

試驗在福建省農業科學院畜牧獸醫研究所兔場基地進行。選擇平均體重為（657.25±102.21）g 的健康福建白兔48 只，隨機分為4 個處理組，對照組飼喂基礎飼糧（A 組，CK），試驗組在基礎飼糧上分別添加200 mg·kg?1大蒜素、0.5%納豆菌、200 mg·kg?1大蒜素+0.5%納豆菌，設置大蒜素處理組（B 組）、納豆菌處理組（C 組）和大蒜素+納豆菌處理組（D組）。每組12 只，飼養于仔兔代謝籠（規格60 cm×40 cm×40 cm），每籠1 只。試驗期為50 d。全價顆粒料飼喂，每天早晚飼喂2 次，乳頭式飲水器自由飲水。飼養管理與免疫程序按常規進行。全價飼糧參照NRC（1977） [18]家兔營養標準和De Blas 等[19]的生長兔營養需求進行配制，基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平（干物質基礎）Table 1 Composition and nutrient levels of basic diets (DM basis)

1.3 指標測定

1.3.1 生長性能測定 試驗于40 日齡正式開始，于90 日齡結束，試驗始末對試驗兔空腹稱重，試驗期每日記錄每只兔采食情況，包括每日喂料量、剩余料量及浪費料量，并觀察試驗期間的腹瀉和死亡情況。計算仔兔的平均日增重（Average daily gain，ADG）、平均日采食量（Average daily feed intake，ADFI）及料重比（Feed/gain，F/G），計算公式為料重比=消耗飼料總量（kg）/增重總量（kg）。試驗結束時，采集每只兔血樣后屠宰，進行屠宰測定，測定全凈膛重、半凈膛重等。無菌采集盲腸內容物進行菌群測定，采集腸道組織樣品用于形態學觀察。

1.3.2 血清抗氧化酶的測定 丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathion peroxidase，GSH-Px）活性和總抗氧化能力（Total antioxidant capacity, T-AOC），均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定。

1.3.3 腸絨毛高度和隱窩深度 家兔屠宰后迅速剖開腹腔，每只家兔十二指腸、空腸和回腸的相同部位各取下一段腸管1 cm（回腸取最上端），生理鹽水沖洗干凈，放入10%中性甲醛中固定。石蠟包埋，連續橫斷切片，厚6 μm，進行常規HE 染色。光鏡下詳細觀察和比較各組腸絨毛形態結構的變化情況。每張切片挑選3 個100 倍視野進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0 軟件，每張切片選取5 根完整的絨毛，分別測量絨毛高度（mm）、隱窩深度（mm）；計數每個視野內絨毛和隱窩的數量，計算視野面積（mm2），求出單位面積內絨毛和隱窩的數量。

1.3.4 盲腸微生物多樣性 取各組家兔盲腸食糜，迅速放置液氮中，備用。

（1） DNA 抽提和 PCR 擴增。根據 E.Z.N.A.?soil DNA kit（Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.）說明書進行微生物群落總 DNA 抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質量，使用NanoDrop 2000 測定DNA 濃度和純度；使用338F（5′-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′）對16S rRNA 基因V3～V4可變區進行 PCR 擴增，擴增程序如下：95 ℃ 預變性3 min，27 個循環（95 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s），然后 72 ℃ 穩定延伸 10 min，最后在4 ℃進行保存（PCR 儀：ABI GeneAmp? 9700 型）。PCR 反應體系為：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol·L?1dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol·L?1）0.8 μL，下游引物（5 μmol·L?1）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補足至20 μL。每個樣本3 個重復。

（2）Illumina Miseq 測序。將同一樣本的PCR 產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen biosciences，union city，CA，USA）進行回收產物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測， 并用Quantus? Fluorometer（Promega，USA）對回收產物進行檢測定量。使用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit 進行建庫：接頭鏈接；使用磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR 擴增進行文庫模板的富集；磁珠回收PCR 產物得到最終的文庫。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進行測序（上海美吉生物醫藥科技有限公司）[20]。

1.4 數據統計分析

采用Excel 2010 和SPSS 20.0 統計軟件對數據進行處理分析，采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）檢驗組間差異顯著性，試驗結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同添加劑對福建白兔生產性能的影響

2.1.1 對腹瀉率和死亡率的影響 由表2 可知，試驗全期，對照A 組的腹瀉率明顯高于試驗組， B 組與C 組腹瀉率相當， D 組的腹瀉率最低；且40～60 日齡A 組的試驗兔腹瀉率和死亡率最高， D 組死亡率和腹瀉率最低。

表2 不同添加劑對福建白兔腹瀉率和死亡率的影響Table 2 Effects of supplements on rates of diarrhea incident and mortality of Fujian white rabbits

2.1.2 對生長性能的影響 由表3 可知，各組的初始體重差異不顯著，試驗結束的終末體重，處理D 組顯著高于處理A 組（P＜0.05），極顯著高于處理B 組（P＜0.01）；平均日采食量處理C 和D 組都極顯著高于處理B 組（P＜0.01）；平均日增重處理D 組均極顯著高于處理A 組、處理B 組（P＜0.01），顯著高于處理C 組（P＜0.05）；與其他組比較，料重比D 組最低，但各組差異不顯著。

表3 不同添加劑對福建白兔生長性能的影響Table 3 Effect of supplements on growth performance of Fujian white rabbits

2.1.3 對福建白兔屠宰性能的影響 由表4 可知，全凈膛重，處理D 組均顯著高于處理A 組（P＜0.05）和處理B 組（P＜0.01）；半凈膛重處理D 組極顯著高于處理A 和處理B 組（P＜0.01），處理C 組顯著高于處理B 組（P＜0.05）。全凈膛率和半凈膛率各組之間差異不顯著。

表4 不同添加劑對福建白兔屠宰性能的影響Table 4 Effect of supplements on slaughter performance of Fujian white rabbits

2.2 對福建白兔血清抗氧化酶的影響

由表5 可知，血清中GSH-Px 含量，處理B、C、D 三組都顯著高于處理A 組，且 B 組和A 組之間差異顯著（P＜0.05），C、D 組和A 組之間差異均為極顯著（P＜0.01）。

表5 不同添加劑對福建白兔血清抗氧化酶的影響Table 5 Effect of supplements on serum antioxidant enzymes of Fujian white rabbits

2.3 對福建白兔腸道形態的影響

由表6～7 可知，不同組別的腸道絨毛長度和數量差異不顯著；回腸隱窩深度處理B 組顯著高于處理C 組（P＜0.05）；空腸隱窩深度，處理B、C、D 組高于處理A 組，且B 組與A 組差異極顯著（P＜0.01），D 組與A 組差異顯著（P＜0.05），B 組顯著高于C 組（P＜0.05）。十二指腸隱窩深度不同組別之間差異不顯著?；啬c隱窩數量A 組顯著高于組C 和D 組（P＜0.05），其他差異不顯著。不同組織切片見圖1。

圖1 福建白兔腸道組織切片形態（100×）Fig. 1 Morphology of sectioned intestinal tissues of Fujian white rabbits (100×)

表6 不同添加劑對福建白兔腸道絨毛長度和隱窩深度的影響Table 6 Effects of supplements on intestinal villus length and crypt depth of Fujian white rabbits（單位：mm）

2.4 對福建白兔盲腸微生物區系的影響

2.4.1 不同添加劑對福建白兔盲腸菌群 Alpha 多樣性分析 腸道微生物測序，對不同組別腸道內容物進行測序，共獲得有效序列數為1 702 885 條，每條序列平均長度為408.64 bp，以97%的序列一致性。由表8 可知，處理A 組的群落多樣性Shannon 指數顯著高于C 組（P<0.05），其他差異不顯著。

表8 試驗各組測序結果及Alpha 多樣性分析Table 8 Sequence and alpha diversity of treatment groups

2.4.2 不同組別福建白兔盲腸菌群結構分析 （1）不同組別福建白兔盲腸菌群門水平的結構分析。不同組別福建白兔盲腸菌群由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門 （Bacteroidetes）、 細菌未分類門（Unclassified_k__norank_d__Bacteria）、 放線菌門（Actinobacteria）；軟壁菌門（Tenericutes）；變形菌門（Proteobacteria）；髕骨細菌門（Patescibacteria）等組成，其中前 3 種菌門是不同組別中菌群的主要組成部分，分別占73.02%、12.03%、2.06%以上（圖2）。

圖2 不同處理組門水平腸道微生物豐度Fig. 2 Intestinal microbial abundance at phylum level of treatment groups

表7 不同添加劑對福建白兔腸道絨毛數量和隱窩數量的影響Table 7 Effects of supplements on intestinal villi population and crypts of Fujian white rabbits（單位：根·mm?2）

（2）不同組別福建白兔盲腸菌群科水平的結構分析。不同組別福建白兔盲腸菌群在科水平以瘤胃菌科Ruminococcaceae、優桿菌科Eubacteriaceae、毛螺菌科Lachnospiraceae、克里斯滕森菌科 Christensenellaceae 等為主，分別占27.28%、13.15%、10.53%、6.86%以上（圖3）。腸道菌梭菌目-0-未分類（Unclassified_o_ Clostridiales）在組間差異顯著（P<0.05），A 組顯著高于D 組，其他差異不顯著（圖4）。

圖3 不同處理組腸道微生物科水平豐度Fig. 3 Intestinal microbial abundance at family level of treatment groups

圖4 不同處理組腸道微生物科水平菌群差異性Fig. 4 Differential intestinal microflora at family level of treatment groups

（3）不同組別福建白兔盲腸菌群屬水平的結構分析。不同組別福建白兔盲腸菌群在屬水平以優桿菌科的norank_f（norank_f__Eubacteriaceae）、瘤胃球菌科的NK4A214 菌屬（Ruminococcaceae_NK4A214_group）、克里斯滕森菌科的R-7 菌屬（Christensenellaceae_R-7_group）、絨毛桿菌科的norank_f__菌屬（norank_f__Muribaculaceae）和梭菌目vadinBB60 菌科的norank_f__菌屬（norank_f__Clostridiales_vadin-BB60_group）為主，分別占9.86%、10.05%、6.83%、7.10%、6.69%以上（圖5）。Ruminococcaceae_UCG-010 在組間差異顯著 (P＜0.05) ，A 組顯著高于C 組；unclassified_o__Clostridiales 在組間差異顯著 (P＜0.05) ，A 組顯著高于D 組（圖6）。

圖5 不同處理組腸道微生物屬水平豐度Fig. 5 Intestinal microbial abundance at genus level of treatment groups

圖6 不同處理組腸道微生物菌群屬水平差異性Fig. 6 Differential intestinal microflora of treatment groups

3 討論

兔是單胃草食動物，斷奶仔兔自由采食，容易發生消化道紊亂，造成腹瀉甚至死亡[21]。本試驗各組的腹瀉率和死亡率較高，這是由于采用自由采食的飼喂方式。處理B 組與對照A 組相比，腹瀉率和死亡率明顯降低，這與Marchese 等[8]研究表明大蒜素可以減少發病率以及降低死亡率的結果一致。何曉政等[17]研究顯示大蒜素和丁酸梭菌聯用可以促進青腳麻雞的生長。大蒜素可提高免疫力[6]，納豆芽孢桿菌具有調節腸道和提高機體免疫力[11]的功效。本試驗全期，對照組的腹瀉率明顯高于試驗組，大蒜素或納豆菌處理組腹瀉情況相當，大蒜素和納豆菌復合處理組（D 組）的腹瀉率最低；且40～60 日齡階段對照A 組腹瀉和死亡數最高，D 組最低，說明大蒜素和納豆芽孢桿菌有降低死亡和腹瀉的作用，而且兩者一起使用效果更佳，其原因可能是處理D 組腸道有害菌unclassified_ o_ Clostridial 顯著低于對照A 組，這也驗證了處理D 組試驗兔的平均日增重和料重比均高于其他組別。

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是體內重要的自由基捕獲酶之一，不僅具有清除自由基和衍生物的作用，還可減少脂質過氧化物的形成，增強機體抗氧化損傷的能力[22]。腸絨毛長短直接影響著動物的生長發育，絨毛長度增加可以增大小腸吸收營養物質的面積。腸隱窩是絨毛根部上皮陷入固有層形成的管狀腺，隱窩深度反映上皮細胞的生產率，上皮細胞從隱窩基部向絨毛端遷移、分化，形成具有吸收功能的絨毛細胞[23]。腸道微生物對宿主的營養代謝、生長、免疫等起著不可忽視的重要作用。而腸道微生物的變化又受到宿主的品種、日糧、所處環境，特別是胃腸道環境的影響，因此宿主與其腸道菌群之間建立了一種共生關系[24]。本試驗發現，處理組血清中的GSH-Px 含量顯著高于對照A 組，這與大蒜素具有清除自由基和抗氧化[5]的功效有關?？漳c隱窩深度對照A 組低于處理組，這可能是由大蒜素可促進食欲且納豆菌有促進益生菌生長的作用所致。

16S rRNA 的高通量測序，多樣性分析得出對照組與試驗組腸道菌群菌落豐富度無明顯差異。菌群結構分析，以厚壁菌門、擬桿菌門為主，兩者占85.05%以上，門水平差異不顯著；不同組別福建白兔盲腸菌群在科水平以瘤胃菌科、優桿菌科、毛螺菌科、克里斯滕森菌科等為主，分別占27.28%、13.15%、10.53%、6.86%以上；不同組別福建白兔盲腸菌群在屬水平以優桿菌科的norank_f 屬、瘤胃球菌科的NK4A214 菌屬、克里斯滕森菌科的R-7 菌屬、絨毛桿菌科的norank_f 菌屬為主，分別占9.86%、10.05%、6.83%、7.10%以上，對照組Ruminococcaceae_UCG-010 顯著高于納豆菌處理（P<0.05）。有報道顯示菌屬Ruminococcaceae_UCG-010 可能影響血糖的升高[25]；He 等[26]的研究表明番茄籽油可以降低小鼠腸道unclassified_o__Clostridiales 菌屬，進而改善小鼠的高血脂癥。對照組unclassified_o__Clostridiales 相對豐度顯著高于大蒜素和納豆菌復合處理組（P＜0.05），說明大蒜素和納豆菌聯合使用可調節腸道菌群，改善血脂。