文心蘭雜交后代的EST-SSR 和SRAP 分子標記鑒定

林榕燕，羅遠華，樊榮輝，葉秀仙，方能炎，鐘淮欽，黃敏玲

（福建省農業科學院作物研究所/福建省特色花卉工程技術研究中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】 文心蘭（Oncidiumhybridum）是蘭科（Orchidaceae） 文心蘭屬（Oncidium） 及其近緣屬的總稱，由超過70 個屬構成，文心蘭屬是其中最大的一個屬[1]。其花色豐富、花型優美、花期長，是重要的盆花和切花種類[2]。目前，我國的文心蘭產業雖已初具規模，但生產中栽培品種仍多為進口，自有品種相對較少[3]，培育性狀優良、商品價值高、具有自主知識產權的新品種已成為文心蘭育種的重要方向。現階段，雜交育種依然是培育文心蘭新品種最為常用的方法，相較于其他蘭科植物，如蝴蝶蘭、卡特蘭等，文心蘭無論是屬內雜交還是屬間雜交的育種難度均較大，花粉敗育、雜交親和力差、授粉結實率低等問題仍是障礙[4]。此外，文心蘭從小苗到開花需要2～3 年，一個品種的選育周期要7～10 年[5,6]，因此，在文心蘭雜交育種過程中，對其雜交后代進行雜種真實性的早期鑒定，篩選出所需要的真雜種是非常有必要的，不僅可以有效提高后代選擇的準確性，還可以降低育種成本，縮短育種周期。【前人研究進展】 目前，植物雜交后代鑒定的方法有很多，傳統的鑒定方法有形態學鑒定、細胞學鑒定、同工酶鑒定等，具有周期長、成本高等問題[7]。隨著分子生物學技術的發展，分子標記技術成為了植物雜交后代鑒定的高效技術手段之一，相較于傳統的鑒定方法，分子標記技術為快速準確地鑒定出真雜交種提供了技術支撐。序列相關擴增多態性（SRAP）標記是一種基于PCR 的分子標記，具有高效、高共顯性、重復性好等特點，前人的研究表明SRAP 標記適用于鐵皮石斛[8]、大豆[9]、百合[10]等多種植物的雜交后代鑒定研究中。表達序列標簽微衛星（EST-SSR）是一種基于表達序列標簽的簡單序列重復設計的分子標記，多應用于植物的遺傳多樣性分析、種質資源鑒定、重要性狀標記等[11?13]。孫清明等[14]利用EST-SSR 標記進行了荔枝雜交群體真假雜種鑒定，實現了100%的鑒定效率，證明了EST-SSR 標記用于荔枝雜交后代鑒定是可行的。【本研究切入點】 本課題組前期通過人工雜交獲得了一批后代株系[15]，若能對這些后代株系進行雜種真實性的早期鑒定，將有利于降低后期選擇的難度，縮短新品種選育周期。基于EST-SSR 和SRAP 分子標記在植物雜交后代鑒定中的可行性，本研究擬利用EST-SSR 和SRAP 分子標記技術，對文心蘭46 個雜交后代株系進行真實性鑒定。【擬解決的關鍵問題】本研究通過開展文心蘭DNA 提取、PCR 擴增、引物篩選等試驗，鑒定出這些雜交后代株系中的真雜種，并分析這些雜交后代株系間的親緣關系及其與親本間的遺傳相似系數，以期為文心蘭雜種后代的快速鑒定及加速育種進程提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以文心蘭黃金午后（WilsonaraGolden Afternoon‘Rich Yellow’）、百萬金幣（OncidiumSweet Sugar‘Million Dollar’）及其46 個雜交后代株系（編號：1～46）為試驗材料，其中，黃金午后為母本，百萬金幣為父本，兩親本的來源及主要性狀見表1。供試的材料均取自福建省農業科學院作物研究所特色蘭花工程化實驗室育種圃。父母本及雜交后代株系均剪取幼嫩葉片，立即保存于液氮中，以待提取DNA。

表1 親本來源及主要性狀Table 1 Source and main traits of the parents

1.2 試驗方法

1.2.1 葉片總DNA 的提取 采用改良CTAB 法[16]進行2 個文心蘭品種及其雜交后代葉片總DNA 的提取，經1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測其完整性和純度后，將DNA 產物置于?20 ℃條件下保存備用。

1.2.2 文心蘭SRAP-PCR 擴增 參考Budak 等[17]的引物，隨機選擇11 條正向引物和16 條反向引物，組成176 對引物組合。PCR 反應體系的總體積為25 μL，其中DNA 模板、上游引物、下游引物均為1.0 μL，含Mg2+的Buffer 為2.5 μL，2.5 mmol·L?1的dNTPs 為2.0 μL，Taq聚合酶為0.3 μL，ddH2O 為17.2μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 預變性5 min；5 個循環的94 ℃變性、35 ℃ 復性、72 ℃ 延伸；30 個循環的94 ℃ 變性、50 ℃ 復性、72 ℃ 延伸；最后72 ℃延伸10 min。擴增產物利用2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，經紫外凝膠成像儀拍照，獲得電泳圖譜。

1.2.3 文心蘭EST-SSR-PCR 擴增 基于本課題組前期設計的21 對文心蘭EST-SSR 標記引物[18]，進行PCR擴增。PCR 反應體系的總體積為25 μL，同SRAP-PCR反應體系。PCR 擴增程序為：94 ℃ 預變性 4 min、變性30 s；各引物對應退火溫度退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環；72 ℃延伸10 min，并保存于4 ℃條件下。PCR 擴增產物先通過2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后經紫外凝膠成像儀拍照，獲得電泳圖譜。

1.2.4 文心蘭雜交后代真實性鑒定 參照Hulya[19]的方法，從供試的SRAP 引物組合和EST-SSR 引物對中篩選出具有父本特征條帶的引物組合，觀察這些引物的擴增條帶圖，若雜交后代株系擴增出的條帶中具有父本特征條帶，則該雜種鑒定為真雜種。

1.2.5 數據分析 觀察分析電泳圖譜，對其中的DNA條帶數進行統計，在同一遷移位置上有擴增條帶的記作1，無條帶的則記作0，在EXCEL 軟件構建（1,0）原始數據矩陣。基于數據矩陣，利用EXCEL軟件計算引物的多態性比率和多態性信息含量，利用NTSYS-pc2.10e 軟件繪制親本與雜交后代間的遺傳距離矩陣與遺傳相似系數矩陣。而后根據遺傳距離矩陣進行聚類分析，獲得聚類圖；基于相似系數矩陣數據，在EXCEL 軟件中計算最小值、下四分位數、中位數、四分位數、最大值，并根據不同數值間的差值繪制親本與雜種間的遺傳相似系數箱式圖。

2 結果與分析

2.1 文心蘭EST-SSR 引物和SRAP 引物的初篩選

將獲得的48 份文心蘭材料DNA 稀釋至相同濃度備用，以父母本及隨機2 份雜交后代株系為模板進行21 對EST-SSR 引物和176 對SRAP 引物的初步篩選，篩選出能擴增出明顯條帶的9 對EST-SSR引物和15 對SRAP 引物。為明確篩選引物對其他文心蘭品種的可用性，利用篩選出來的共24 對引物對供試的48 個樣品進行擴增，發現6 對EST-SSR 引物和10 對SRAP 引物在48 個樣品中均能擴增出清晰條帶，且父本能擴增出母本沒有的特異性條帶。

2.2 雜交后代的真實性鑒定

利用篩選出的 6 對EST-SSR 引物對46 個雜交后代株系進行真實性鑒定（表1），在引物Hga19 的擴增條帶中發現了6 條父本特征帶，且供試的 46 個雜交后代株系均具有父本特異性條帶，記錄為真雜種；此外，引物Hga15 的擴增條帶中有2 條父本特征帶，鑒定出46 個雜交后代株系均為真雜種，鑒定效率達100%（圖1-A）。而引物Htag5 僅鑒定出10 個雜交后代株系，鑒定效率為21.74%。綜合6 對EST-SSR引物的鑒定結果，供試的46 個雜交后代株系均鑒定為真雜種，鑒定效率為100%。

圖1 文心蘭雜交后代的EST-SSR 引物Hga15（A）和SRAP 引物組合Me1+Em3（B）鑒定結果Fig. 1 Identification of Oncidium hybrid progenies using EST-SSR primer Hga15 (A) and SRAP primer combinations Me1+Em3 (B)

利用篩選出的 10 對SRAP 引物組合對46 個雜交后代株系進行真實性鑒定（表2），發現在Me1+Em3引物組合的擴增結果中（圖1-B），供試的 46 個雜交后代株系均具有父本特異性條帶，鑒定為真雜種，鑒定效率達100%；Me6+Em8 及Me10+Em2 引物組合同樣鑒定出46 個雜交后代株系均為真雜種，鑒定效率達100%；在Me3+Em1 引物組合的擴增結果中，鑒定出33 個雜交后代株系為真雜種，鑒定效率為71.74%。此外，在父本特征條帶比較中，Me8+Em1引物組合擴增出的父本特征條帶最多，為7 條。綜合10 對SRAP 引物組合的鑒定結果，鑒定效率同樣為100%，46 個雜交后代株系均鑒定為真雜種。

表2 文心蘭雜交后代鑒定的EST-SSR 和SRAP 標記引物信息Table 2 Information on EST-SSR and SRAP primer pairs used for Oncidium hybrid progeny identification

2.3 EST-SSR 和SRAP 引物的多態性分析

對篩選出來的6 對文心蘭EST-SSR 引物進行多態性分析發現，每對引物平均擴增到6.5 個條帶，其中多態性條帶數在5.67 個，各引物的多態性比率分布為75.00% ～100.00%。引物Hga19 擴增出9 條多態性條帶，其多態性信息含量最高，為0.87；引物Hga15 僅擴增出3 條多態性條帶，其多態性信息含量最小，為0.66；供試的6 對文心蘭EST-SSR 引物平均多態性信息含量為0.80（表3）。

對篩選出來的10 對SRAP 引物組合進行多態性分析發現，10 對引物組合共擴增出99 個條帶，其中多態性條帶數有81 個，多態性比例為81.82%。Me7+Em1 和Me10+Em2 引物組合的多態性比例為100.00%，Me6+Em8 引物組合的多態性比例僅為66.67%。在多態性信息含量比較中，Me8+Em1 引物組合最高，為0.92；Me3+Em1、Me6+Em2、Me6+Em7 和Me7+Em1引物組合的多態性信息含量均為0.85；供試的10 對SRAP 引物組合平均多態性信息含量為0.87（表3）。

表3 文心蘭EST-SSR 和SRAP 引物多態性分析Table 3 Polymorphism of EST-SSR and SRAP primer pairs ofOncidium

2.4 文心蘭親本與雜交后代株系的聚類分析

基于EST-SSR 和SRAP 的擴增結果建立（0,1）型數據，利用NTSYS-pc2.10e 軟件，構建文心蘭親本與雜交后代株系的聚類圖。從聚類圖（圖2）可以看出，供試的48 個文心蘭材料間的遺傳距離變化在0.04～0.36，其中，1 號雜交后代株系和2 號雜交后代株系的親緣關系最近，父本百萬金幣與其他品種存在較大的遺傳差異。在遺傳距離為0.28 處，供試的48 個文心蘭材料分為3 大聚類群：第Ⅰ類包括46 個雜交后代株系； 第Ⅱ類為母本黃金午后；第Ⅲ類為父本百萬金幣。供試的46 個雜交后代株系在遺傳距離上均與母本黃金午后更為接近，表現為偏母性遺傳。

圖2 基于EST-SSR 和SRAP 分子標記的文心蘭聚類分析Fig. 2 Clustering Oncidium based on EST-SSR and SRAP molecular markers

2.5 文心蘭親本與雜交后代的遺傳相似性分析

根據EST-SSR 和SRAP 的擴增結果， 利用NTSYS-pc2.10e 軟件構建文心蘭親本與雜交后代株系的遺傳相似系數矩陣。在遺傳相似系數矩陣數據中，母本黃金午后與父本百萬金幣間的遺傳相似系數僅為0.36，為遺傳相似系數矩陣中的最低值。基于遺傳相似系數矩陣，利用EXCEL 繪制親本與雜交后代的遺傳相似系數箱式圖（圖3）。發現父本百萬金幣與雜交后代株系間的遺傳相似系數在0.51～0.64，遺傳相似系數平均值為0.57；母本黃金午后與雜交后代株系間的遺傳相似系數在0.62～0.75，遺傳相似系數平均值為0.68。雜交后代株系與母本的遺傳相似系數大于其與父本間的，說明雜交后代與母本的親緣關系更近，表現為偏母性遺傳。這與供試的雜交后代株系在聚類過程中與母本的親緣關系更近的結果相吻合。46 個雜交后代株系間的遺傳相似系數為0.64～0.95，遺傳相似系數平均值為0.79，高于雜交后代與父母本間的遺傳相似系數。

圖3 文心蘭親本與雜種間遺傳相似系數Fig. 3 Coefficients of genetic similarity between Oncidium parents and hybrid progenies

3 討論

雜交后代早期鑒定是雜交育種工作中的一個重要環節，快速篩選出真雜種，對提高育種效率、縮短育種周期具有重要意義。分子標記技術因其具有操作方便，不受環境限制等優點，已成功應用于多種植物雜交后代真實性鑒定。李勝男等[20]利用InDel 特異性分子標記對蘋果和梨遠緣雜種后代進行鑒定；尹躍等[21]利用SSR 分子標記對枸杞種間雜交后代群體進行鑒定；胡鳳榮等[22]利用ISSR 分子標記鑒定了風信子3 個雜交組合的雜交后代真實性；劉穎鑫等[23]利用SSR 和SRAP 標記研究了菊花腦與甘菊種間雜種的真實性。本研究利用EST-SSR 標記和SRAP 標記對文心蘭雜交后代株系進行了早期鑒定，共篩選出6 對EST-SSR 和10 對SRAP 引物組合用于文心蘭雜交后代的真實性鑒定研究中，供試的46 個雜交后代株系均鑒定為真雜種，鑒定效率為100%，說明EST-SSR 和SRAP 分子標記技術應用于文心蘭雜交后代真實性鑒定研究中是可行的。

在雜交后代真實性鑒定的過程中，發現在一個引物對或引物組合中未鑒定出真雜種的雜交后代株系在另一個引物對或引物組合中被鑒定出了，說明不同引物對或引物組合所鑒定的結果存在差異，因此，利用互補原理，采用多個引物對或引物組合進行鑒定，效果更好[24]。研究還發現，供試的SRAP 引物組合擴增到的平均父本特征帶數較EST-SSR 引物擴增到的多，且平均鑒定效率較EST-SSR 引物高，說明SRAP 標記較EST-SSR 標記在文心蘭雜交后代鑒定中更占優勢。而在引物多態性比較中，篩選出的EST-SSR 標記引物的多態性條帶占比為87.18%，SRAP 引物組合多態性條帶占比為81.82%，說明供試的48 個文心蘭材料具有較高的遺傳多樣性，也表明在多態性分析中，EST-SSR 標記較SRAP 標記更有優勢。綜上所述，2 種標記各有自身優勢，故基于2種標記的綜合擴增結果進行文心蘭雜交后代株系的聚類分析和遺傳相似系數分析，結果更為可靠。忻雅等[25]對草莓遺傳多樣性的研究也證實了，SSR+SRAP聯合標記分析能更加全面、有效地揭示草莓種質間的親緣關系。

聚類分析在一定程度上反映了分析個體的相似性，對文心蘭親本及雜交后代進行聚類分析，可以作為判斷后代株系與親本親緣關系遠近的依據。本研究中，黃金午后與百萬金幣通過屬間雜交，獲得了46 個雜交后代株系，供試的雜交后代株系在聚類過程中先與母本黃金午后聚在一起，說明46 個雜交后代株系與母本的親緣關系更近，這與雜交后代株系與母本的平均遺傳相似系數大于父本的分析結果相互印證。在雜交育種過程中，通常認為遺傳距離較遠的親本之間雜交更有可能產生豐富變異。本研究中，母本黃金午后與父本百萬金幣間的遺傳相似系數僅為0.36，為文心蘭新品種的選育奠定了良好基礎。對文心蘭親本與雜交后代的遺傳相似系數分析發現，親本與雜交后代株系間的遺傳相似系數在0.51～0.64 和0.62～0.75，說明在供試的雜交后代株系中可能出現了一些差異較大的個體，這為優異中間材料的選育提供了機會。研究還發現，雜交后代株系間的遺傳相似系數中位數明顯高于親本間的遺傳相似系數，說明該組合雜交后代的遺傳基礎趨向于變窄，類似的研究結果在菊花[26]和藍莓[27]中均有報道。因此，在今后文心蘭的育種工作中，應通過選擇遺傳差異較大的品種進行雜交，以盡量提高雜交后代的遺傳多樣性。

綜上，本研究利用6 對EST-SSR 和10 對SRAP引物組合用于文心蘭雜交后代的真實性鑒定，鑒定效率達100%，并從分子水平探討了不同雜交后代株系間及雜交后代株系與親本間的親緣關系遠近，發現供試的雜交后代株系均表現為偏母性遺傳。研究結果表明EST-SSR 和SRAP 分子標記用于文心蘭雜交后代群體的真實性鑒定和遺傳多樣性分析研究中是有效的。本試驗結果為文心蘭雜交后代真實性的鑒定、種質資源評價提供了技術支撐，鑒定出的真雜種后代加快了文心蘭新品種的選育進程，為文心蘭新品種選育研究奠定基礎。