薏苡葉斑病病原菌生物學特性及防治藥劑毒力評估

侯翔宇，黃世勇，姚錦愛，謝世勇，黃建成 *

（1. 福建省作物有害生物監測與治理重點實驗室/福建省農業科學院植物保護研究所，福建 福州 350013；2. 武夷山市種子站，福建 武夷山 354300）

0 引言

【研究意義】薏苡（Coix lacryma-jobiL.），又名薏苡仁、苡米、苡仁等，屬禾本科（Gramineae）薏苡屬（Coix），是我國傳統的藥食兼用的食品，具有豐富的營養價值及藥用功效，在福建、貴州、云南、廣西等均有種植[1?2]。福建省薏苡種植面積約7 000 hm2，年產量約2.0×107kg。近年來，在福建薏苡種植基地調查發現薏苡葉斑病發病嚴重，發病初期引起水漬狀淺黃色病斑，嚴重時造成黃褐色病變直至死亡。經鑒定該病是由（Curvularia coicisCastellani）侵染薏苡葉片引起的薏苡葉斑病 (Coix leaf spot, CLS) ，是薏苡產區重要的真菌病害，田塊病株率高達80 %以上，造成產量下降，嚴重制約薏苡的生產[3]，目前，對薏苡葉斑病主要從病原鑒定、發生情況及防治方法等方面進行研究，在多篇文獻中報道使用多菌靈、百菌清等傳統殺菌劑作為主要的化學防治藥劑[4?5]，但長期施用這些藥劑，易使病原菌抗藥性增強，防治效果不佳。因此，明確薏苡葉斑病病原菌生物學特性，評估市面上用于防治薏苡葉斑病藥劑的防控潛力，對于該病害田間科學用藥和高效防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】國內學者研究表明，氯氟醚菌唑、吡唑醚菌酯、咯菌腈等三類新型藥劑，對多種植物葉斑病具有不錯的防治效果。潘連富等[6]明確了氯氟醚菌唑懸浮劑對香蕉葉斑病病原菌暗雙孢菌（Cordana musae）的田間防效，認為該藥對香蕉葉斑病的防治效果較好；代玉立等[7]采用菌絲生長速率法測定了閩南地區4 個薏苡產區72 株薏苡葉斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感性，認為吡唑醚菌酯對薏苡葉斑病有較好的防治效果，李戌清等[8]研究了14 種殺菌劑對番茄葉斑病病原菌番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici）菌絲生長的抑制作用，結果表明咯菌腈對番茄葉斑病效果最好?！颈狙芯壳腥朦c】關于薏苡葉斑病菌（C. coicis）的生物學特性及其防治藥劑毒力評估的研究有待深入進行。【擬解決的關鍵問題】明確薏苡葉斑病病原菌的生物學特性，測定氯氟醚菌唑、吡唑醚菌酯、咯菌腈等防治藥劑的毒力指數并評估它們二元復配劑的聯合作用效果。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試藥劑為97 %氯氟醚菌唑原藥（Mefentrifluconazole，三唑類，巴斯夫歐洲公司）、96 %吡唑醚菌酯原藥（Pyraclostrobin，甲氧基丙烯酸酯類，江蘇耘農化工有限公司）、98 % 咯菌腈原藥（Fludioxonil，吡咯類，西安近代科技實業有限公司），對照藥劑為98.1 %多菌靈原藥（Carbendazim，苯并咪唑類，輝豐農化股份有限公司）。

供試菌株為薏苡葉斑病菌（Curvularia coicis），由福建省農業科學院植物保護研究所分離保存。

供試培養基馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：新鮮去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉16 g、去離子水1000 mL。察氏（Czapek）培養基：硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂粉16 g、蒸餾水

1000 mL。

1.2 病原菌生物學特性測定

1.2.1 溫度對病原菌菌絲生長的影響 用無菌的5 mm

直徑打孔器打取培養5 d 的病原菌邊緣菌餅轉接于PDA 培養基中央，分別置于10、15 、20、25 、30、35 、40 ℃恒溫暗培養，6 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑。每處理3 皿，重復3 次。

1.2.2 pH 對病原菌菌絲生長的影響 取直徑為5 mm

的菌餅接種于用0.1 mol·L?1HCl 和0.1 mol·L?1NaOH調配pH 為4、5、6、7、8、9、10 的PDA 培養基上，后置于28 ℃恒溫培養，6 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑。每處理3 皿，重復3 次。

1.2.3 光照條件對病原菌菌絲生長的影響 取直徑為5 mm 的菌餅轉接于PDA 培養基中央，分別置于全黑暗、全光照和黑暗光照交替（12 h/12 h）3 種不同光照條件下，28 ℃恒溫培養，6 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑。每處理3 皿，3 個重復。

1.2.4 不同碳源、氮源對病原菌菌絲生長的影響以察氏培養基為基礎培養基，將培養基中的蔗糖分別替換成等量的淀粉、麥芽糖、乳糖、葡萄糖，制成不同碳源的培養基以不含碳源培養基作為對照；采取同樣的方法將等量的蛋白胨、牛肉浸膏、酵母、硫酸銨分別替換培養基中的硝酸鈉，制成不同氮源的培養基，以不含氮源培養基為對照。再將5 mm 的活化菌餅接于不同碳源、氮源培養基中央，28 ℃恒溫培養，6 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑。每處理3 皿，重復3 次。

1.3 室內毒力試驗

1.3.1 薏苡葉斑病病原菌防治藥劑的毒力測定與評估采用菌絲生長速率法測定[9]。將氯氟醚菌唑、吡唑醚菌酯、咯菌腈和多菌靈的質量濃度均設為0.002、0.01、0.05、0.25、1.25 和6.25 mg·L?1，無菌操作條件下，在PDA 培養基內加入各藥劑母液，制成系列濃度的含藥PDA 培養基平板。供試菌株在PDA 平板上純化培養4～5 d 后，用5 mm 規格打孔器打取菌落邊沿新鮮菌餅接種于含不同質量濃度藥劑的PDA 平板中央，每處理3 皿，重復3 次，后置于28 ℃恒溫培養，6 d 后用十字交叉法測量每個培養基的菌落直徑。計算供試藥劑每個處理濃度對菌絲生長的抑制率，并計算其對供試菌株的有效抑制中濃度EC50和毒力指數。菌絲生長抑制率/%=[（對照組菌落直徑-藥劑處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑?菌餅直徑）]×100。毒力指數TI=（對照藥劑EC50/供試藥劑EC50）×100。

1.3.2 薏苡葉斑病病原菌防治藥劑聯合作用測定與評估 在1.3.1 的基礎上，將3 種供試藥劑進行復配，設定氯氟醚菌唑與咯菌腈、氯氟醚菌唑與吡唑醚菌酯、吡唑醚菌酯與咯菌腈共3 組混劑組合，每個組合均按有效成分質量配比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9 復配，質量濃度均設為0.002、0.01、0.05、0.25、1.25 和6.25 mg·L?1；根據3 組混劑組合各自設定的配比和濃度，按照1.3.1 的方法配制成系列濃度的含藥培養基平板，以不含藥的PDA 培養基作空白對照，每個處理3 皿，重復3 次；取菌齡一致、直徑5 mm 的菌餅分別接種于每個培養基平板中央，后置于28 ℃恒溫培養，6 d 用十字交叉法測量每個培養基的菌落直徑，計算3 組混劑組合每個處理濃度對菌絲生長的抑制率和每組復配藥劑的抑制中濃度EC50及共毒系數CTC。共毒系數計算法，以單劑EC50較低者為標準藥劑計算混劑共毒系數（CTC）：單劑毒力指數TI=（標準藥劑EC50/供試藥劑EC50）×100、復配劑實際毒力指數ATI=（標準藥劑EC50/復配劑EC50）×100、復配劑理論毒力指數TTI=TIA×PA+TIB×PB（TIA 和TIB 分別為單劑A 和單劑A 的毒力指數，PA 和PB 分別為復配劑中各單劑的有效成分百分含量）和共毒系數CTC=（復配劑的實際毒力指數ATI/復配劑理論毒力指數TTI）×100。共毒系數分級：（CTC≥120 為增效作用，80≤CTC＜120 為相加作用，CTC＜80 為拮抗作用）。

1.4 數據統計與分析

用DPS 7.05 軟件計算毒力回歸方程、有效抑制中濃度EC50及相關系數等數據，利用Duncan’s 新復極差法對生物學特性結果進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 生物學特性

2.1.1 溫度對病原菌菌絲生長的影響 病原菌在10～40 ℃條件下均能生長，10～25 ℃菌絲生長速度呈升高趨勢，25～40 ℃菌絲生長速度呈下降趨勢。菌絲適宜生長溫度為25～30 ℃，在25 ℃條件下菌絲生長最快，培養 6 d 菌落直徑為 85.33 mm（圖1）。結果表明，該病原菌最適生長溫度為25 ℃，對低溫和高溫具有一定耐性。

圖1 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響Fig. 1 Effect of temperature on C. coicis mycelial growth

2.1.2 pH 對病原菌菌絲生長的影響 病原菌在pH 4～10 條件下均能生長，pH 4～8 菌絲生長速度呈升高趨勢，pH 9～10 菌絲生長速度呈下降趨勢。菌絲適宜生長pH 為7～9，在pH 8 條件下菌絲生長最快，培養 6 d 菌落直徑為80.00 mm（圖2），結果表明，該病原菌喜偏堿性或中性環境，最適生長pH 值為 8。

圖2 不同pH 對病原菌菌絲生長的影響Fig. 2 Effect of pH on C. coicis mycelial growth

2.1.3 光照條件對病原菌菌絲生長的影響 表1 結果顯示，病原菌在全黑暗、黑暗光照交替和全光照處理下均能較好地生長，培養 6 d 菌落直徑分別為80.33、79.67、80.67 mm，相互之差異不顯著，說明光照條件對該病原菌菌絲生長影響不顯著。

表1 光照條件對病原菌菌絲生長的影響Table 1 Effect of light exposure on C. coicis mycelial growth

2.1.4 不同碳氮源對病原菌菌絲生長的影響 試驗結果（表2）表明，病原菌在供試5 種碳源中均能生長，且生長速度差異明顯。以淀粉為碳源的培養基中菌落生長速度最快，培養 6 d 的菌落直徑為74.33 mm，其次是以蔗糖、葡萄糖和乳糖為碳源的培養基處理組，其菌落生長速度均顯著高于缺碳源的對照，其中以麥芽糖為碳源的培養基上菌落生長速度最低。不同氮源的結果顯示，病原菌在以蛋白胨為氮源的培養基中菌落生長速度最快，培養6 d 后直徑達83.67 mm；在以酵母、牛肉浸膏和硝酸鈉為氮源的培養基上，菌落生長速度明顯高于缺氮源的對照組，而以硫酸銨為氮源的培養基菌落生長速度最低。因此，病原菌最佳供試碳源為淀粉、最佳供試氮源為蛋白胨。

表2 不同碳氮源對病原菌菌絲生長的影響Table 2 Effects of carbon and nitrogen sources on C. coicis mycelial growth

2.2 薏苡葉斑病病原菌防治藥劑的毒力測定與評估

試驗結果（表3）顯示，供試的3 種殺菌劑對薏苡葉斑病病原菌均具有不同程度的抑制作用，其中氯氟醚菌唑的抑菌效果最好，EC50為0.0055 mg·L?1，毒力指數是多菌靈的234.83 倍；其次為吡唑醚菌酯，EC50為0.0132 mg·L?1，毒力指數是多菌靈的97.84倍、最后為咯菌腈，EC50為0.0152 mg·L?1，毒力指數是多菌靈的84.97 倍。說明這3 種藥劑對薏苡葉斑病病原菌的毒力高于多菌靈，具有較好的防控潛力。

表3 薏苡葉斑病防治藥劑的毒力評估Table 3 Toxicity of fungicides on C. coicis

2.3 薏苡葉斑病病原菌防治藥劑聯合作用測定與評估

2.3.1 氯氟醚菌唑與吡唑醚菌酯對薏苡葉斑病病原菌聯合作用的測定與評估 由表4 可知，氯氟醚菌唑與吡唑醚菌酯混劑組合的9 個有效成分質量配比均對薏苡葉斑病菌起到有效的抑制作用，抑制中濃度EC50為0.0035～0.0092 mg·L?1；它們的共毒系數CTC均大于120，所有配比表現為增效作用。其中5∶5 配比的增效作用最明顯，共毒系數CTC為221.85。說明氯氟醚菌唑與吡唑醚菌酯合理比例復配能顯著增加防治薏苡葉斑病菌的效果，兩者復配的最佳有效成分質量配比為5∶5。

表4 氯氟醚菌唑與吡唑醚菌酯對薏苡葉斑病病原菌的聯合作用Table 4 Toxicity of mefentrifluconazole and pyraclostrobin combination on C. coicis

2.3.2 氯氟醚菌唑與咯菌腈對薏苡葉斑病病原菌聯合作用的測定與評估 由表5 可知，氯氟醚菌唑與咯菌腈混劑組合的9 個有效成分質量配比對薏苡葉斑病菌較好的抑制作用，EC50為0.009 5～0.014 2 mg·L?1；但所有配比均表現不具有增效作用，9∶1、8∶2、7∶3、5∶5 和4∶6 配比的共毒系數CTC小于80，表現為拮抗作用，其他4 個配比的共毒系數CTC大于80 且小于120，表現為相加作用?？梢?，氯氟醚菌唑與咯菌腈復配不具有增效作用，適用單劑防控薏苡葉斑病。

表5 氯氟醚菌唑與咯菌腈對薏苡葉斑病病原菌的聯合作用Table 5 Toxicity of mefentrifluconazole and fludioxonil combination on C. coicis

2.3.3 吡唑醚菌酯與咯菌腈對薏苡葉斑病病原菌聯合作用的測定與評估 由表6 可知，吡唑醚菌酯與咯菌腈混劑組合的9 個有效成分質量配比對薏苡葉斑病有較好的抑制作用，EC50為0.0118～0.0203 mg·L?1；但所有配比均表現不具有增效作用，5∶5、4∶6 和1∶9 配比的共毒系數CTC小于80，表現為拮抗作用；其他6 個混劑配比的共毒系數CTC大于80 且小于120，表現為相加作用?？梢?，吡唑醚菌酯與咯菌腈復配不具有增效作用，適用單劑防控薏苡葉斑病。

表6 吡唑醚菌酯與咯菌腈對薏苡葉斑病病原菌的聯合作用Table 6 Toxicity of pyraclostrobin and fludioxonil combination on C. coicis

3 討論與結論

病原菌的生物學特性是監控病害發生的前提條件，目前國內尚未有薏苡葉斑病病原菌（Curvularia coicis）的生物學特性研究的報道。本研究表明，該病原菌適宜在25～30 ℃下生長，最適生長溫度為25 ℃，與李潤根等[10]報道百合葉斑菌（C. pseudobrachyspora）的生長溫度相似；在pH 為4～10 均能生長，在pH 為7～9 生長較快，最適pH 為8，與鄭肖蘭等[11]報道玉米彎孢霉葉斑病菌（C. lunata）的生長pH 范圍相似；該病原菌能利用供試的5 種碳源和5種氮源，最佳碳源為淀粉，最佳氮源為蛋白胨；在全黑暗、黑暗光照交替和全光照3 種培養條件下菌絲生長速度差異不顯著，與徐輝等[12]報道水稻彎孢葉斑病病原（C. lunata）的生長光照條件研究結果相符。

薏米葉斑病的防治以化學防治為主，但長期使用傳統的殺菌劑，如多菌靈、百菌清等，易導致抗藥性的產生。因此，需對市面上可用于防治薏苡葉斑病的藥劑進行毒力評估，以期找到具有防控潛力的藥劑。同時，通過農藥復配技術可以達到減藥增效，延緩抗藥性產生的作用[13?14]。本研究評估了3 種類型殺菌劑對薏苡葉斑病病原菌（C. coicis）的毒力及其聯合作用。試驗結果顯示，氯氟醚菌唑、吡唑醚菌酯和咯菌腈這3 類防治藥劑對薏苡葉斑病病原菌均有很好的抑制作用，毒力指數分別為多菌靈對照的234.83、97.84、84.97 倍；進一步評估它們之間復配聯合作用，發現僅氯氟醚菌唑與吡唑醚菌酯復配聯合作用表現為增效作用，其中5∶5 配比的增效作用最顯著，共毒系數CTC達221.85；而氯氟醚菌唑與咯菌腈、吡唑醚菌酯與咯菌腈這2 種復配聯合作用均未表現出增效作用。

可見，氯氟醚菌唑、吡唑醚菌酯和咯菌腈均具有較好的防控潛力，在實際應用中可替代多菌靈使用；氯氟醚菌唑與吡唑醚菌酯合理比例復配對抑制薏苡葉斑病菌有明顯的增效作用，有助于提高薏苡葉斑病的防治效果，降低生產成本。后續試驗中，可進一步評估氯氟醚菌唑與吡唑醚菌酯復配混劑在應用時，藥劑殘留及對非靶標生物的影響等指標，為薏苡葉斑病防治藥劑的選擇、應用及延緩抗藥性的產生提供參考。