福建省彩葉草葉斑病病原菌的分離鑒定與室內(nèi)藥劑篩選

王榮波，陳姝樽，李本金，劉裴清，鄧麗霞，翁啟勇

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】彩葉草 [Plectranthus scutellarioides(L.) R.Br.]，屬于唇形科（Lamiaceae）鞘蕊花屬（Coleus）多年生常綠草本觀葉植物，原產(chǎn)自熱帶或亞熱帶地區(qū)的印度尼西亞、馬來(lái)西亞、菲律賓等地，現(xiàn)世界各地均有栽培[1]。彩葉草品種多樣、葉色絢麗、葉型美觀，觀賞價(jià)值很高，是園林造景常用的觀葉植物。目前，彩葉草的應(yīng)用不再局限于城市環(huán)境景觀的建設(shè)，人們對(duì)其藥用價(jià)值的關(guān)注成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)[2]。彩葉草具有極高的藥用價(jià)值，可以治療多種疾病，如頭痛、擦傷、眼炎及消化不良等[3]。彩葉草中所含有的迷迭香酸是一種高價(jià)值的天然酚類(lèi)化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及抗氧化的功能，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域[4?6]。近年來(lái)，隨著彩葉草研究的深入及應(yīng)用領(lǐng)域的拓展，其需求量日益增長(zhǎng)，因此，彩葉草人工栽培面積正在不斷擴(kuò)大。由于種植面積的擴(kuò)大且多采用設(shè)施栽培，造成彩葉草病害日趨嚴(yán)重。漳州是福建花卉苗木最大的生產(chǎn)出口基地[7]，彩葉草作為基礎(chǔ)性花卉裝飾品種種植面積龐大，但2017 年以來(lái)，葉枯病在種植地普遍發(fā)生，危害嚴(yán)重，發(fā)病率在50%以上，已嚴(yán)重影響了彩葉草觀賞價(jià)值，給當(dāng)?shù)貜臉I(yè)者帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。明確葉斑病病原菌可為采取有效措施對(duì)該病害進(jìn)行防控奠定基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】目前，關(guān)于彩葉草病害的相關(guān)研究報(bào)道較少，最主要的病害是由Peronospora belbahrii引起的霜霉病，該病害在日本、英國(guó)、德國(guó)、美國(guó)及巴西等國(guó)家均普遍發(fā)生[8?10]。在意大利，由黃萎病菌Verticillium dahliae引起的黃萎病與鏈格孢Alternaria alternata引起的葉片壞死作為彩葉草新病害進(jìn)行了報(bào)道[11?12]。國(guó)內(nèi)關(guān)于彩葉草真菌病害的報(bào)道主要為介紹病害癥狀、危害情況及防治措施等[13?16]。【本研究切入點(diǎn)】漳州地區(qū)2017–2020 年的6–9 月為彩葉草葉斑病的高發(fā)期，嚴(yán)重降低了彩葉草的觀賞性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，亟需明確葉斑病病原菌種類(lèi)，進(jìn)而制定有效的防控措施。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)病原菌分離純化、致病性檢測(cè)、形態(tài)學(xué)特征觀察、ITS與LSU 序列分子生物學(xué)鑒定等方式對(duì)彩葉草葉斑病病原菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定，并在室內(nèi)測(cè)定6 種殺菌劑對(duì)該病原菌的毒力，以明確病原菌種類(lèi)，篩選出高效防治藥劑，為彩葉草葉枯病的發(fā)生和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植株：帶病彩葉草植株于2017 年7 月在福建漳州花卉種植基地采集；供試菌株ZZCYC1706 分離自彩葉草葉部病斑。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）：稱取200 g 馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000 mL 煮沸30 min，紗布過(guò)濾，趁熱分別加入20 g葡萄糖與20 g 瓊脂充分溶解，蒸餾水定容至1000 mL，分裝，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

供試藥劑：95%嘧霉胺（pyrimethanil），京博農(nóng)化科技股份有限公司；99%腐霉利（procymidone），瀘州東方農(nóng)化有限公司；96%啶菌噁唑（pyrisoxazole），沈陽(yáng)科創(chuàng)化學(xué)品有限公司；96%啶酰菌胺（boscalid），陜西美邦農(nóng)藥有限公司；98%異菌脲（iprodione），江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司；96.4%克菌丹（captan），瀘州東方農(nóng)化有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原真菌的分離培養(yǎng) 采用常規(guī)組織分離法[17]

進(jìn)行病原菌分離，將采集的病葉清洗干凈后，在病葉的病健交界處切取5 mm × 5 mm 的組織，用75%酒精處理45 s 后，2% NaClO 浸泡2 min，無(wú)菌蒸餾水沖洗3 次，然后置于滅菌且干燥的吸水紙上，吸收并晾干水分。晾干后的葉片組織在無(wú)菌條件下接種于含有50 mg·mL?1的氨芐和利福平的PDA平板上。于28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d 后，挑取菌落邊緣少量菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，并進(jìn)行單孢分離獲得純培養(yǎng)物（代表菌株為ZZCYC1706）。

1.2.2 致病性測(cè)定 柯赫氏法則驗(yàn)證采用分生孢子懸浮液接種[18]進(jìn)行：將純化后的菌株ZZCYC1706于28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，待病原菌產(chǎn)孢后，用無(wú)菌水將孢子洗脫下來(lái)并配置成1×106個(gè)·mL?1的分生孢子懸浮液備用。選取苗齡為3 個(gè)月長(zhǎng)勢(shì)一致的彩葉草植株，將配制好的分生孢子懸浮液均勻噴灑到植株的葉片上，每個(gè)處理接種5 株，同時(shí)設(shè)置無(wú)菌水為對(duì)照。接種后置于25 ℃培養(yǎng)箱黑暗條件下保濕24 h，然后轉(zhuǎn)移至12 h 光周期條件下保濕培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。待接種植株發(fā)病后，對(duì)發(fā)病葉片重新進(jìn)行病原菌分離，并觀察與原始菌株是否一致。

1.2.3 致病菌形態(tài)學(xué)鑒定 將純化后的菌株接種于PDA 平板上，28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)和顏色；挑取菌落邊緣菌絲，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)；用無(wú)菌水將分生孢子洗脫并配制成懸浮液，吸取5 μL 孢子懸浮液置于載玻片上，于光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)特征并測(cè)量其大小。根據(jù)Lawrence 等[19]提供的形態(tài)學(xué)特征對(duì)分離菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.4 致病菌分子生物學(xué)鑒定 采用CTAB 法提取病原菌基因組DNA[20]。以提取的DNA 為模板，分別擴(kuò)增核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ribosomal DNA internal transcribed spacer, ITS）序列和線粒體核糖體大亞基RNA 基因（large subunit ribosomal RNA gene, LSU）片段。采用的通用引物對(duì)序列分別為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ ITS4（5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3 ′ ）和LR5（5 ′-ATCCTG AGGGAAACTTC-3′）/ LROR（5′-GTACCCGCTGA ACTTAAGC-3′）[21]，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系：25 μL 反應(yīng)體系，包含2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上下游通用引物 (10 μmol ·L?1) 各1 μL，模板DNA 1 μL，用雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL 反應(yīng)產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

測(cè)序所得核酸序列提交至NCBI（http://www.ncbi.nlm.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并登錄GenBank 獲得登錄號(hào)。在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已經(jīng)報(bào)道的12 種鏈格孢屬（Alternariaspp.）真菌的ITS和LSU 序列，以Verticillium dahlia為外群，利用IQTREE（http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/）在線軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。經(jīng)MAFFT（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/）進(jìn)行多重序列比對(duì)后采用Maximum likelihood（ML）方法并設(shè)置Ultrafast bootstrap 參數(shù)為1 000 進(jìn)行構(gòu)建，其他設(shè)置均采用默認(rèn)的參數(shù)[22]。

1.2.5 殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定6 種供試藥劑對(duì)彩葉草葉枯病病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性[23]。每種藥劑根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果分別設(shè)5 個(gè)濃度梯度，用丙酮溶液作為溶劑。其中包括質(zhì)量濃度為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0 μg·mL?1的95%嘧霉胺，質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10、1.00、5.00 μg·mL?1的98%異菌脲，質(zhì)量濃度為6.25、50.00、100.00、250.00、500.00 μg·mL?1的96.4%克菌丹，質(zhì)量濃度為 0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 μg·mL?1的96%啶菌噁唑，質(zhì)量濃度為 10、20、40、80、160 μg·mL?1的99%腐霉利，質(zhì)量濃度為 10、30、90、180、270 μg·mL?1的96%啶酰菌胺。將藥劑溶于丙酮后配制成不同濃度的母液，然后將篩選藥劑母液按照相應(yīng)濃度梯度采用體積比加入PDA 培養(yǎng)基中混勻，制成不同濃度藥劑的PDA 平板，以加等量丙酮溶液的PDA 平板為對(duì)照，各處理重復(fù)3 次。取菌落邊緣生長(zhǎng)一致直徑為6 mm 的菌絲塊接種到含藥平板中央，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)待對(duì)照組菌落直徑生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的80%左右時(shí)，用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落直徑，取平均值，計(jì)算相對(duì)抑制率，相對(duì)抑制率/%=（對(duì)照菌落直徑?處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑?菌餅直徑）×100。取藥劑濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)x，菌絲生長(zhǎng)相對(duì)抑制率的概率值為縱坐標(biāo)y，求出毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并計(jì)算出各藥劑對(duì)彩葉草葉枯病病原菌的有效抑制中濃度EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 彩葉草葉枯病田間癥狀

2017 至2020 年的6-9 月，福建漳州花卉種植基地的彩葉草葉斑病大面積發(fā)生，病葉率達(dá)80%以上，病株率可達(dá)50%（圖1-A）。該病發(fā)生初期，主要在葉片正面和背面形成黑色圓形或不規(guī)則病斑（圖1-C、D），后病斑逐漸干枯變色，最終多個(gè)病斑匯合形成大面積枯死斑，葉片皺縮干枯脫落（圖1-B），導(dǎo)致彩葉草的觀賞性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值喪失。

圖1 彩葉草葉斑病自然發(fā)病癥狀Fig. 1 Leaf spots on coleus occurred in nature

2.2 病原菌的分離與致病力測(cè)定

采用常規(guī)組織分離法對(duì)采集的病葉進(jìn)行病原菌分離，純化后獲得菌株ZZCYC1706。分離菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 后，菌落較為致密，呈絮狀平鋪生長(zhǎng)，菌落灰黑色，菌絲呈絨毛狀或帶絮狀、較緊密，最外圍菌絲為灰白色，菌落邊緣整齊，向內(nèi)顏色逐漸加深，具有清晰的輪紋（圖2-A）。當(dāng)在PDA 平板上生長(zhǎng)至10 d 時(shí)，菌絲變成灰白色，呈現(xiàn)絮狀（圖2-B），菌落面呈青灰色（圖2-C）。采用分生孢子懸浮液接種彩葉草葉片，接種2 d 后產(chǎn)生針點(diǎn)狀黑色小病斑，隨后逐漸擴(kuò)大成不規(guī)則或圓形病斑（圖2-E），其癥狀與彩葉草田間自然發(fā)病前期癥狀一致，無(wú)菌水噴施的陰性對(duì)照葉片未見(jiàn)發(fā)病癥狀（圖2-D），說(shuō)明分離菌株ZZCYC1706 為彩葉草葉斑病的病原菌。

圖2 菌落形態(tài)和致病性鑒定Fig. 2 Colony morphology and pathogenic assay

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)特征觀察

菌株ZZCYC1706 在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 后產(chǎn)生孢子，挑取表面菌絲在顯微鏡下觀察分生孢子梗、分生孢子及菌絲的形態(tài)。初生分生孢子梗較短，直立或稍有彎曲，有分隔，呈褐色，具有分支，末端有分生孢子著生位點(diǎn)（圖3-A）；菌株分生孢子倒圓棒狀、長(zhǎng)橢圓形或橢圓形，顏色為淺褐色至褐色（圖3-B），大小為（8.0～13.5） μm×（22.5～43.0）μm，具有2～7 個(gè)橫向隔膜，大部分為5 個(gè)，分隔處略隘縮或隘縮；0～2 個(gè)縱向隔膜，大多數(shù)為1 個(gè)；大多數(shù)分生孢子逐漸變窄形成一個(gè)錐形頂端喙（圖3-C）。基于上述形態(tài)特征和菌落形態(tài)，結(jié)合文獻(xiàn)資料初步判斷該病原菌為鏈格孢菌Alternariaalternata[19,21]。

圖3 病原菌分生孢子梗及分生孢子形態(tài)特征Fig. 3 Morphological characteristics of conidiophore and conidia

2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

對(duì)分離菌株ZZCYC1706 的ITS、LSU基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和測(cè)序，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示擴(kuò)增的ITS、LSU條帶單一清晰，分子量大小與預(yù)期一致。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后分別獲得大小為 543 bp 和914 bp 的基因片段序列，提交GenBank 進(jìn)行登記，獲得登錄號(hào)分別為OK413398、OK413397。將序列在NCBI 上進(jìn)行BLAST 同源比對(duì)，結(jié)果表明分離的病原菌與Alternaria alternata的同源性最高，其序列與登錄號(hào)MZ047493 和KY000652 的同源性分別達(dá)到99.81%和100%。

進(jìn)一步聯(lián)合ITS、LSU基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并以大麗輪枝菌（V. dahliae）作為外群，結(jié)果（圖4）顯示，分離菌株ZZCYC1706 與A. alternata（菌株號(hào)CBS 106.24）聚于同一分支，且支持率達(dá)到100%，能夠明顯區(qū)分于同屬其他真菌。基于分子生物學(xué)鑒定，并結(jié)合菌株形態(tài)特征，將彩葉草葉斑病病原菌鑒定為鏈格孢菌A. alternata。

圖4 基于ITS 和LSU 序列構(gòu)建鏈格孢屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree of Alternaria spp. based on ITS and LSU sequences

2.5 常用殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

分別用嘧霉胺、異菌脲、克菌丹、啶菌惡唑、腐霉利、啶酰菌胺等6 種殺菌劑對(duì)病原菌ZZCYC1706進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。結(jié)果表明，6 種藥劑對(duì)病原菌A. alternata的菌絲生長(zhǎng)都有一定的抑制作用。如表1所示，所測(cè)殺菌劑的抑菌概率值y和殺菌劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成的對(duì)數(shù)值x的相關(guān)系數(shù)r均在0.9 以上，甚至達(dá)到0.999，說(shuō)明所建立的回歸方程是有效的。在供試的6 種藥劑中，96%啶菌惡唑抑菌效果最好，其EC50為0.621 μg·mL?1，其次為98%異菌脲和95%嘧霉胺，EC50分別為1.155 、5.258 μg·mL?1；而96.4%克菌丹效果較差，EC50值最高，為89.010 μg·mL?1。

表1 6 種藥劑對(duì)彩葉草葉斑病病原菌的毒力測(cè)定Table 1 Toxicities of 6 fungicides on A. alternata

3 討論與結(jié)論

彩葉草是城市景觀建設(shè)中廣泛使用的一種重要的觀賞花卉，同時(shí)也極富藥用價(jià)值[1,2]。彩葉草原產(chǎn)于亞太熱帶地區(qū)，現(xiàn)在世界各國(guó)廣泛栽培。其栽培過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)灰霉病、疫病、白粉病、菌核病、黑斑病等病害，尤其是葉部病害嚴(yán)重影響彩葉草的觀賞價(jià)值[13]。但是，目前關(guān)于彩葉草葉斑病的研究較少，國(guó)內(nèi)僅對(duì)其危害癥狀、發(fā)生情況及防治措施進(jìn)行介紹，對(duì)該病害病原物進(jìn)行分離鑒定和系統(tǒng)研究有待深入進(jìn)行。本研究通過(guò)傳統(tǒng)植物病原菌鑒定方法與分子生物學(xué)手段相結(jié)合鑒定了彩葉草葉斑病的致病菌為鏈格孢（A. alternata），并對(duì)其防治藥劑進(jìn)行了篩選。

傳統(tǒng)植物病原菌的鑒定采用柯赫氏法則結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察的方法，形態(tài)學(xué)主要通過(guò)分生孢子、菌絲形態(tài)差異等特征來(lái)確定病原菌的分類(lèi)。而鏈格孢屬（Alternariaspp.）是一個(gè)在生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和形態(tài)學(xué)上都非常豐富的真菌群，該屬絕大多數(shù)真菌都具有串聯(lián)的分生孢子，由于分生孢子的形態(tài)較為接近，界限模糊，給鏈格孢屬真菌的種類(lèi)鑒定帶來(lái)一定的困難[21]。形態(tài)學(xué)與DNA 序列如ITS 等核糖體序列相結(jié)合常用于真菌的系統(tǒng)分類(lèi)，但I(xiàn)TS等包含的信息有限，只能根據(jù)序列分析鏈格孢屬種間形態(tài)差異大的菌種，而形態(tài)差異小的則不能區(qū)分[24]。本研究將ITS 與LSU 的序列進(jìn)行聯(lián)合分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，明確了彩葉草葉斑病的病原菌為鏈格孢A. alternata。

A. alternata是鏈格孢屬（Alternariaspp.）的模式菌種，能夠在100 多種植物上引起葉斑病和其他病害，也可引起多種作物采后病害，在世界范圍內(nèi)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[25]。在我國(guó)，已經(jīng)報(bào)道在枇杷[26]、葡萄[27]、蝙蝠葛[28]、苦蕎麥[29]、鳳尾蘭[30]、野生水稻[31]等植物上引起葉斑病或褐斑病，但是在彩葉草上屬于首次報(bào)道。目前，關(guān)于該病害的化學(xué)防治藥劑的報(bào)道較少，張丹華等[26]對(duì)枇杷上分離的鏈格孢進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)咪鮮胺、嘧菌酯、甲基硫菌靈、多菌靈及苯醚甲環(huán)唑5 種殺菌劑對(duì)菌株生長(zhǎng)均有抑制作用。其中，苯醚甲環(huán)唑的抑制效果最好，EC50為3.84 mg·L?1。趙熾娜等[32]研究發(fā)現(xiàn)申嗪霉素對(duì)鏈格孢菌的抑制中濃度（EC50）為17.5616 mg·L?1，并且當(dāng)申嗪霉素質(zhì)量濃度為50.0 mg·L?1時(shí)，對(duì)該菌的抑制率為71.21%。本研究選用嘧霉胺、異菌脲、克菌丹、啶菌惡唑、腐霉利、啶酰菌胺等6 種殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，其中啶菌惡唑的EC50為0.621 μg·mL?1，遠(yuǎn)優(yōu)于之前報(bào)道的藥劑，并且篩選的異菌脲和嘧霉胺也具有良好的抑菌效果。同時(shí)，啶菌惡唑?qū)儆谶拎哼蜻?lèi)殺菌劑，異菌脲是二甲酰亞胺類(lèi)高效廣譜、觸殺型殺菌劑，而嘧霉胺為苯氨基嘧啶類(lèi)殺菌劑，因此，在防治葉斑病過(guò)程中，可以將這3 種藥輪換使用，以提高田間防效并延緩病菌產(chǎn)生抗藥性。