粘質沙雷氏菌FZSF02 中轉錄調控因子OmpR 的生物學功能

賈憲波，劉方晨，趙 恪，林俊杰，方 宇，陳濟琛 *

（1. 福建省農業(yè)科學院土壤肥料研究所，福建 福州 350003；2. 福建農林大學資源與環(huán)境學院，福建 福州 350001；3. 福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350001）

0 引言

【 研究意義】 粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）是腸桿菌科中的一類革蘭氏陰性短桿狀細菌，該菌在土壤、水體等環(huán)境中廣泛分布[1]。粘質沙雷氏菌發(fā)現(xiàn)于1819 年，20 世紀70 年代確認該種中某些菌株為條件致病菌[2]。近年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，粘質沙雷氏菌可以產生多種有潛力的次生代謝物質，如肽類抗生素，生物表面活性劑serrawettin W1 和靈菌紅素[3?5]等。該菌也可作為底盤微生物高產N-乙酰神經氨酸[6]、乙偶姻和丁二醇等高附加值產品[7?8]。因此，粘質沙雷氏菌已成為有重要前景的工業(yè)微生物菌種，研究其產物合成及調控相關基因以揭示其產物合成機制有助于挖掘其生產潛力。【前人研究進展】靈菌紅素類物質由于具有抗菌和抗腫瘤等生物活性而成為近年研究熱點，粘質沙雷氏菌是特異性產靈菌紅素的最主要菌種[9]。研究表明，粘質沙雷氏菌合成靈菌紅素受多個基因調控，包括細菌群體感應相關基因，雙組分系統(tǒng)相關基因和其他調控基因[10]。雙組分調控系統(tǒng)廣泛存在于細菌中，參與壓力響應、細菌形態(tài)、 運動性、 菌毛合成及毒力表現(xiàn)等[11]，典型的雙組分系統(tǒng)由作為傳感器的跨膜組氨酸激酶和作為效應分子的一個細胞質蛋白組成[12]。目前已知雙組分系統(tǒng)PigQ/PigW、PhoB/PhoR 和EepR/EepS 正調控粘質沙雷氏菌靈菌紅素的合成[13?15]，雙組分系統(tǒng)RssB/RssA[16]對靈菌紅素的合成起到負調控作用。更多靈菌紅素合成相關調控基因的揭示有助于理解該類菌株合成靈菌紅素的調控機制和規(guī)律。【本研究切入點】EnvZ/OmpR 是一個典型的雙組分調控系統(tǒng)，但是其對粘質沙雷氏菌靈菌紅素合成及其他生物學特性的影響知之甚少。【擬解決的關鍵問題】利用從一株高產靈菌紅素粘質沙雷氏菌FZSF02 菌株[17]的Tn5 轉座子突變體庫中獲得一株ompR突變株，檢測ompR敲除對菌株生物學特性的影響，初步揭示EnvZ/OmpR 雙組分調控系統(tǒng)對粘質沙雷氏菌的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和質粒 大腸桿菌DH5α 由本實驗室保存，粘質沙雷氏菌FZSF02 由本實驗室自土壤中分離，粘質沙雷氏菌FZSF02ompR:: Tn5 源自本實驗室由FZSF02 構建的Tn5 轉座子突變體庫。

1.1.2 主要試劑和儀器 供試培養(yǎng)基及抗生素購自生工生物工程（上海）股份有限公司，高保真DNA 聚合酶 PrimeSTAR?Max DNA Polymerase（Takara，R045A），克隆試劑盒Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit 購自北京艾德萊生物科技有限公司， 轉座子突變試劑盒EZ-Tn5? Tnp Transposome? Kit (TSM99K2, Epicentre)， 細菌總RNA 提取試劑盒(TIANGEN，DP430)購自天根生化科技（北京）有限公司，瓊脂粉（BD：Becton,Dickinson and Company），吐溫80（國藥集團），脫脂奶粉（BD：Becton, Dickinson and Company），血瓊脂平板（青島海博生物），96 孔細胞培養(yǎng)板（Greiner Bio-One， No.655180）， 美 國 MD SpectraMax190 全波長酶標儀，電轉化儀Gene Pulser Xcell（Bio-Rad）。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因的序列分析 調取目的基因的編碼蛋白序列，通過NCBI（National Center for Biotechnology Information）網站中blastp 功能比對查找與目的蛋白同源的蛋白序列并預測蛋白的功能，挑選隸屬不同種屬的同源蛋白序列，應用MEGA5.0 軟件Neighborjoining 法構建該蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 電擊轉化感受態(tài)細胞的制備 LB 瓊脂平板上挑取FZSF02 菌株1 個單菌落置于50 mL 液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min?1培養(yǎng)12 h 作為種子液，以1% （v/v）的接種量轉接至50 mL 液體LB 培養(yǎng)基中37 ℃，180 r·min?1培養(yǎng)至OD600約1.0 時將盛有菌液的搖瓶冰浴30 min，冰浴結束后轉移至50 mL 離心管于4 ℃離心機中5 000 r·min?1離心10 min；棄上清后用40 mL 預冷的無菌水洗滌后4 ℃離心10 min，重復用無菌水洗滌離心1 次；用40 mL 的冰預冷的10%甘油洗滌后4%離心10 min，重復用10%甘油洗滌離心一次；用0.5 mL，10%甘油懸浮菌體沉淀，以100 μL 每管分裝至1.5 mL 離心管后保存在?80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 突變株及敲除菌株的獲得ompR突變株的構建應用轉座子突變試劑盒EZ-Tn5? Tnp Transposome? Kit (TSM99K2, Epicentre)。轉座子插入位置的鑒定應用High TAIL-PCR[18?19]。ompR基因的敲除應用同源重組法，擴增含有啟動子的卡那抗性基因，應用ompR前端引物OmpRFF 和OmpRFR 擴增ompR上游同源臂，應用OmpRBF 和OmpRBR 擴增ompR基因的下游同源臂，將3 段序列通過重疊PCR（Overlap PCR）拼接后連接Zero Background pTOPOBlunt 質粒，在氨芐青霉素和卡那霉素雙抗性LB 瓊脂平板上篩選陽性克隆子。以陽性克隆子質粒為模板應用引物OmpRFF 和OmpRBR 擴增獲得含有ompR上游同源臂、卡那霉素抗性基因和ompR下游同源臂的DNA 片段，片段經純化后用滅菌超純水洗脫。上述PCR 擴增所用引物詳細序列見表1。通過電擊轉化將上述DNA 片段轉化FZSF02 野生型菌株，電轉參數為：25 μF, 200 ohm, 1 800 V。在卡那霉素質量濃度為100 mg·L?1的LB 瓊脂平板上挑取單克隆驗證。

表1 供試引物Table 1 Primers used in this study

1.2.4 細菌生長曲線測定 挑單菌落至50 mL 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min?1培養(yǎng)FZSF02 野生型菌株WT 和基因敲除菌株ΔompR過夜作為種子液，調整種子液含量至OD600為1.0，分別以0.5%的接種量轉接WT 和ΔompR至50 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，分別于27 ℃和37 ℃，180 r·min?1培養(yǎng)，每隔3 h 取樣測定菌液的OD600值，繪制生長曲線。

1.2.5 產靈菌紅素能力的檢測 用接種環(huán)分別挑取野生型菌株WT，轉座子突變菌株FZSF02ompR::Tn5 和基因敲除菌株FZSF02ΔompR劃線于分為三區(qū)的LB 固體瓊脂平板上，平板倒置于27℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h 后觀察菌株的產色能力。

1.2.6 qPCR 試驗 用細菌RNA 提取試劑盒(TIANGEN，DP430)提取菌株的總RNA，應用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（TIANGEN，KR118）進行反轉錄獲取菌株cDNA，應用TransStart?Green qPCR SuperMix （TransGen，AQ101）進行qPCR 擴增。qPCR以16SrDNA 作為內參基因（引物為16SF 和16SR），分別應用引物pigAF/pigAR，pigFF/pigFR 和pigNF/pigNR 檢測靈菌紅素合成基因簇中pigA，pigF和pigN基因的轉錄水平變化。qPCR 引物序列信息見表1。

1.2.7 細菌生物被膜形成能力測定 分別挑取WT和ompR 菌株單菌落至50 mL 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r·min?1培養(yǎng)過夜作為種子液，調整2 個種子液含量至OD600值為1.0 后以0.5%的接種量轉接至50 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，從接種后的培養(yǎng)基中吸取200 μL 至96 孔細胞培養(yǎng)板中分別置于27 ℃和37 ℃培養(yǎng)，設置多個復孔作為重復。培養(yǎng)36 h 測定各孔OD600后將培養(yǎng)板中的菌液吸出，用PBS 緩沖液清洗各孔5 次，倒置在濾紙上10 min 以徹底除去孔中的PBS，向各孔加入200 μL 1%的結晶紫染料，染色30 min 后吸出結晶紫，用PBS 清洗各孔5 次，倒置放置培養(yǎng)板10 min 除去殘留的PBS，用200 μL 無水乙醇溶解各孔中的結晶紫，測定各孔OD595值。菌株的產膜能力用各菌株OD595/OD600值表示。

1.2.8 細菌運動性測定 配制瓊脂含量分別為0.3%（m/V）和0.7%（m/V）的LB 瓊脂平板，分別吸取2 μLOD600值為2.0 的WT 和ΔompR菌液滴至各平板的中心位置，置于27℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察瓊脂含量為0.3%（m/V）的平板上菌株的游動（swimming）能力，0.7%瓊脂平板上菌株的涌動（swarming）能力。

1.2.9 細菌產酶能力測定 制備脫脂奶粉含量為1%（m/V）的LB 瓊脂平板用以檢測蛋白酶產生能力，吐溫80 含量為1%（V/V）的LB 瓊脂平板用以檢測脂肪酶產生能力，應用血瓊脂平板檢測菌株的溶血素產生能力。將2 μLOD600值為1.0 的菌液滴于瓊脂平板上，置于27 ℃培養(yǎng)48 h 通過觀察蛋白酶和脂肪酶酶活圈的有無和大小比較菌株的產酶能力；27 ℃培養(yǎng)24 h 和7 d 觀察溶血素活性。

1.2.10 菌株脅迫耐受性測定 菌株的脅迫耐受性實驗參考Brzostek 等[20]和Gao 等[21]的方法進行。菌株分別在pH 3.0 處理10 min、 55 ℃處理5 min、15 mmol·L?1過氧化氫處理10 min 和2 mol·L?1的氯化鈉處理1 h 后稀釋涂布LB 瓊脂平板進行菌落計數，以不經脅迫處理的菌株的菌數作為對照，分別計算經各脅迫因素處理后菌株的存活率。

2 結果與分析

2.1 OmpR 序列分析

粘質沙雷氏菌FZSF02 菌株ompR基因有720 個堿基（NCBI 序列號：QJU42212.1），編碼由239 個氨基酸組成的OmpR 蛋白。序列比對分析顯示其氨基酸序列在不同物種間較為保守，與從前100 個目標序列（Max target sequences）中所選代表不同屬種的20 株菌的相似性為99.16%～100.00%，系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示出類似結果（圖1）。其中，與3 株沙雷氏菌屬菌株的序列相似性為100.00%，與大腸桿菌等其他序列相似性為99.16%～99.58%。

圖1 粘質沙雷氏菌FZSF02 菌株OmpR 基于氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 1 Phylogenetic analysis on OmpR from S. marcescens FZSF02 with its homologous proteins

2.2 基因敲除菌株的構建及鑒定

應用同源重組法構建ompR缺失菌株，挑取具卡那霉素抗性的疑似單菌落應用引物OmpRFF 和OmpRBR 驗證，分別以FZSF02 野生株和Tn5 轉座子突變株FZSF02ompR:: Tn5 作為對照。結果（圖2）顯示，以野生株FZSF02 基因組為模板擴增得到大小為720 bp 的單一條帶，為ompR完整序列；以FZSF02ompR:: Tn5 基因組為模板擴增得到1 920 bp 的單一條帶，該序列由1 200 bp 的Tn5 轉座子序列和被其插入的720 bp 的ompR序列組成；以FZSF02ΔompR基因組為模板擴增得到大小為1 540 bp 的條帶，該序列由ompR上游300 bp，下游300 bp 和中間940 bp 的卡那抗性基因組成。瓊脂糖凝膠電泳和測序結果均表明由卡那抗性基因替換掉120 bpompR基因序列的ompR缺失菌株FZSF02ΔompR構建成功。

圖2 粘質沙雷氏菌FZSF02 菌株ompR 基因敲除驗證Fig. 2 Agarose gel electrophoresis identification of ompRknockout S. marcescens FZSF02

2.3 生長能力檢測

生長曲線顯示FZSF02 和FZSF02ΔompR在27 ℃（圖3-A）和37℃（圖3-B）條件下在LB 液體培養(yǎng)基中的生長能力相似。FZSF02 在27 ℃培養(yǎng)條件下24 hOD600值達到最大值6.60，48 h 降至6.13；菌株ΔompR24 h 最高值為6.44，48 h 降至6.27。37 ℃培養(yǎng)條件下，F(xiàn)ZSF02 在第21 hOD600值達到最大5.74，此后逐步降低至48 h 4.1；ΔompR21 h 達到最大值5.80，48 h 降低至4.0。上述數據說明ompR基因的缺失對該菌的生長無明顯影響。

圖3 FZSF02 野生菌株與ompR 敲除菌株FZSF02ΔompR 的生長曲線Fig. 3 Growth curves of WT and ΔompR of FZSF02

2.4 OmpR 缺失對FZSF02 產靈菌紅素的影響

LB 固體平板試驗顯示，ompR轉座子插入突變菌株FZSF02ompR::Tn5 和缺失菌株FZSF02ΔompR均喪失靈菌紅素產生能力（圖4-A）。Pig 基因簇大小約20 kb，由14 個基因pigA-pigN按順序排列；pigA，pigF和pigN分別是基因簇第1 個、第6 個和第14 個基因，上述三個基因的表達水平可以反映該基因簇總體表達水平。 qPCR 顯示，F(xiàn)ZSF02ΔompR菌株中靈菌紅素合成基因簇中pigA，pigF和pigN基因的表達水平分別降低為野生型菌株的3.8%，2.0%和2.1%（圖4-B），說明OmpR 對靈菌紅素合成的影響是通過調控靈菌紅素合成基因簇的轉錄實現(xiàn)的。

圖4 OmpR 對Serratia marcescens FZSF02 產靈菌紅素能力及靈菌紅素合成基因表達的影響Fig. 4 Effects of OmpR on prodigiosin-producing ability and expressions of prodigiosin biosynthesis genes of S. marcescens FZSF02

2.5 ompR 缺失影響FZSF02 生物被膜形成能力

生物被膜測定結果顯示ompR 部分缺失后生物被膜形成能力降低，37 ℃培養(yǎng)條件下FZSF02ΔompR的生物膜量較FZSF02 野生型菌株降低37.5%（P＜0.01)，27 ℃培養(yǎng)條件下生物被膜量降低15.1%（P＜0.01)，表明OmpR 參與了該菌生物被膜的合成（圖5）。

圖5 OmpR 對Serratia marcescens FZSF02 生物膜合成能力的影響Fig. 5 Effect of OmpR on biofilm-producing ability of S.marcescens FZSF02

2.6 OmpR 對FZSF02 運動和產酶能力的影響

檢測野生型菌株和基因敲除菌株FZSF02 ΔompR在瓊脂含量為0.3%的LB 平板上的游動能力（swimming），菌株FZSF02 和ΔompR的菌落直徑分別為7.32 cm 和7.18 cm；在0.7%瓊脂含量的LB平板上的涌動能力（swarming）試驗顯示FZSF02 和ΔompR的菌落直徑分別為5.51 cm 和5.67 cm，數值無顯著性差異（圖6），說明OmpR 對該菌的運動性無明顯影響。野生型菌株WT 和FZSF02ΔompR均有產蛋白酶能力（酶活圈直徑分別為2.1 cm 和2.2 cm）（圖7-A）和脂肪酶能力（酶活圈直徑分別為1.6 cm和1.7 cm）（圖7-B），從酶活圈直徑評價二者產酶能力無明顯區(qū)別。WT 和FZSF02ΔompR溶血能力相似，在培養(yǎng)第24 h 時均無明顯溶血圈（圖7-C），培養(yǎng)至第7 天時都產生微弱的溶血圈（圖7-D）。

圖6 Serratia marcescens FZSF02 和FZSF02ΔompR 的運動能力Fig. 6 Mobility of S. marcescens FZSF02 and FZSF02ΔompR

圖7 Serratia marcescens FZSF02 和FZSF02ΔompR 的產酶能力Fig. 7 Enzyme-producing abilities of S. marcescens FZSF02 and FZSF02ΔompR

2.7 ompR 對FZSF02 響應脅迫的影響

檢測了野生型菌株和基因敲除菌株FZSF02ΔompR在高溫，低pH，高鹽和強氧化環(huán)境下的存活能力。55 ℃高溫處理后野生型菌株和?ompR的存活率分別為0.15%和0.11%；pH3.0 條件下處理后存活率分別為22.72%和28.35%；2 mol·L?1NaCl 處理后的存活率分別為92.45%和90.65%；氧化劑0.22 mol·L?1H2O2處理后的存活率分別為22.40%和23.84%。說明上述脅迫條件下二者存活率無明顯差異（表2）。

表2 脅迫條件下WT 與?ompR 的存活率Table 2 Survival rates of WT and ?ompR under stress（單位：%）

3 討論與結論

本研究成功構建了粘質沙雷氏菌FZSF02 的ompR敲除菌株，通過對突變體和野生型的對比研究了OmpR 對粘質沙雷氏菌FZSF02 靈菌紅素產生能力，生物膜形成能力，產酶能力，運動性和適應脅迫等生物學特性的影響。

粘質沙雷氏菌合成靈菌紅素受已報道的30 多種基因調控[22]，雙組分調控系統(tǒng)是其中重要的一類調控基因。目前在粘質沙雷氏菌菌株中發(fā)現(xiàn)的參與色素合成調控的雙組分系統(tǒng)有PigQ/PigW[13]（與BarA/UvrY 系統(tǒng)高度同源[23]）、PhoB/PhoR[14]、RssB/RssA[16]和 EepR/EepS[15]。PigQ/PigW，PhoB/PhoR 和eepR/eepS雙組分系統(tǒng)是通過效應蛋白直接與pigA上游啟動子區(qū)結合激活靈菌紅素基因簇的表達而正向調控靈菌紅素合成[13?15]；RssB/RssA 調控系統(tǒng)通過RssB 與pigA上游啟動子直接結合抑制靈菌紅素基因簇表達從而負調控靈菌紅素的合成[16]。本研究EnvZ/OmpR 雙組分調控系統(tǒng)效應蛋白基因ompR敲除后菌株完全喪失靈菌紅素合成能力，對pigA-N 基因簇中分別處于基因簇上游、中游和下游的pigA、pigF和pigN基因轉錄水平應用qPCR 檢測，結果顯示ompR敲除菌株中靈菌紅素合成基因簇中3 個基因轉錄水平明顯降低，說明轉錄調控因子OmpR 正調控該菌株靈菌紅素的合成，該調控可能通過影響整個基因簇的轉錄實現(xiàn)。ompR是本研究新鑒定的參與粘質沙雷氏菌靈菌紅素合成調控的雙組分系統(tǒng)效應基因，有別于已報道的其他4 種雙組分調控系統(tǒng)，其是否與PigQ/PigW，PhoB/PhoR 和eepR/eepS雙組份系統(tǒng)類似通過與pigA 上游啟動子直接結合從而正調控靈菌紅素基因簇的表達有待通過凝膠遷移試驗和DNaseI 足跡試驗等進一步研究。

OmpR 對多種微生物生物膜的形成有重要影響。ompR缺失或突變降低大腸桿菌[24?25]，Yersinia enterocolitica[26]和 腸 炎 沙 門 氏 菌Salmonella enteritidis[27]生物被膜的形成，但是對Acinetobacter baumanniiStrain AB5075 生物被膜形成能力無影響[28]。菌株FZSF02ompR缺失菌株生物被膜形成量在37 ℃時降低37.5%，降低程度與Yersinia enterocolitica的ompR突變株類似（降低33%）[26]，小于腸炎沙門氏菌Salmonella enteritidis（降低75%以上）[27]。上述結果暗示OmpR 對細菌生物被膜形成的影響有一定的普遍性。

OmpR 影響細菌多個微生物學特性，雖然在不同種屬間OmpR 序列高度保守，但是在不同菌株中其作用不同甚至相反。ompR敲除后Acinetobacter baumanniiStrain AB5075 的游動和涌動能力下降[26]，但是在Xenorhabdus nematophila[29]中運動能力顯著增強。Xenorhabdus nematophila ompR基因敲除菌株蛋白酶，脂肪酶和溶血能力均明顯增強[29]；Yersinia enterocolitica菌株ompR基因敲除后對高鹽滲透壓、低pH、過氧化氫和高溫脅迫條件的適應性均明顯降低[20]；但是Yersinia pestisompR基因敲除菌株對高鹽、低pH 和高溫條件較野生型菌株更為敏感，但是對過氧化氫耐受性增強[21]。本研究對菌株FZSF02 上述生物學特性進行探討，顯示ompR敲除后該菌運動性，產酶能力及環(huán)境脅迫的適應性均無明顯變化。說明OmpR 在粘質沙雷氏菌FZSF02 菌株中功能與已報道的菌株不同，這反映了OmpR 在不同微生物中調控功能的多樣性和復雜性。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)在粘質沙雷氏菌FZSF02 菌株中OmpR 特異性正調控靈菌紅素的合成，同時一定程度上影響生物被膜的形成。EnvZ/OmpR 代表一個新的靈菌紅素合成調控系統(tǒng)，其具體調控機制有待深入研究。