瑤藥止痛散質量標準研究*

莫海玲，蔣璐慧，農英高，李以軍，林素梅，周海堅

（廣西壯族自治區民族醫院·廣西醫科大學附屬民族醫院，廣西 南寧 530001）

瑤藥止痛散由毛兩面針、洋金花、草烏、山烏龜、莪術等10 味藥材組方，可解毒散結、消腫止痛、補氣行血、溫通經絡，且使用較安全[1-3]，臨床多用于治療癌性疼痛。方中毛兩面針、洋金花、草烏為君藥，毛兩面針為蕓香科植物毛葉兩面針的干燥根和莖，瑤藥稱入山虎，是瑤藥“五虎”之一[4]，具有活血化瘀、行氣止痛、祛風通絡的功效，其主要有效成分為氯化兩面針堿。洋金花為茄科植物曼陀羅，瑤藥稱辣喝咪[5]，具有止咳平喘、麻醉止痛、散瘀消腫、鎮靜安神功效，主要有效成分為東莨菪堿、莨菪堿、曼陀羅堿等。草烏具有祛風除濕、溫經止痛功效。莪術、山烏龜為方中臣藥，山烏龜具有清熱解毒、理氣止痛的功效[5]，莪術具有行氣破血、消積止痛功效。瑤藥止痛散目前尚無質量標準，為確保該制劑在臨床使用的安全性和有效性，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對制劑中毛兩面針、洋金花、草烏進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對毛兩面針的主要有效成分氯化兩面針堿進行定量分析，為制訂瑤藥止痛散的質量標準提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2030 型高效液相色譜儀，包括紫外檢測器、柱溫箱、LabSolutions 色譜數據工作站（日本Shimadzu 公司）；XS 205 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.1 mg / 0.01 mg）；KQ-300DB 型數控超聲清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；HHitech 和泰水純化系統（上海和泰儀器有限公司）；DLF-28 型分級連續投料粉碎機（溫州頂級醫療器械有限公司）。

1.2 試藥

瑤藥止痛散（本院自制，批號分別為20190607，20190608，20190609）；氯化兩面針堿對照品（批號為110848-201604，純度為91.0%），氫溴酸東莨菪堿對照品（批號為100049-201009，純度為91.7%），烏頭堿對照品（批號為110720-201111，純度為98.8%），次烏頭堿對照品（批號為110798-201308，純度為98.6%），洋金花對照藥材（批號為121058-200503），草烏對照藥材（批號為121338-200401），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；二甲苯、乙酸乙酯、甲醇、異丙醇、濃氨試液、磷酸等均為分析純；水為純化水。

1.3 藥材

毛兩面針（批號為1809034）、洋金花（批號為1811151）、草烏（批號為D1703003）、山烏龜（批號為1811081）、莪術（批號為1811092）等藥材均購自廣西張益堂中藥飲片有限公司，經我院周海堅副主任中藥師鑒定為正品，作為對照藥材。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

毛兩面針：取樣品3 g，精密稱定，加乙醇40 mL，超聲（功率300 W，頻率40 kHz，下同）處理60 min，放冷至室溫，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液；取毛兩面針對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液；按止痛散處方和工藝制備缺毛兩面針的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液；稱取氯化兩面針堿對照品適量，精密稱定，用乙醇溶解，制成氯化兩面針堿質量濃度為0.025 mg/mL 的對照品溶液。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法[6]試驗，吸取上述4 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（10∶2.5∶2.5∶0.5∶0.05，V/ V/ V/ V/ V）為展開劑，置紫外光燈（波長365 nm）下檢視[7]。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾[8]。詳見圖1 A。

洋金花：取樣品3 g，精密稱定，加濃氨試液5 mL，混勻，加三氯甲烷20 mL，搖勻，靜置過夜，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液；另取洋金花對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液；按止痛散處方和工藝制備缺洋金花的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液；精密稱取氫溴酸東莨菪堿對照品，用甲醇溶解，制成氫溴酸東莨菪堿質量濃度為1 mg/mL 的對照品溶液。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法[6]試驗，吸取上述4 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-濃氨試液（20 ∶3.5 ∶0.5，V/ V/ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液[9]。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾[8]。詳見圖1 B。

草烏：取樣品3 g，精密稱定，加氨試液10 mL 潤濕，加乙醚20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液；另取草烏對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液；按止痛散處方和工藝制備缺草烏的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液；精密稱取烏頭堿對照品、次烏頭堿對照品，用異丙醇-三氯甲烷（1 ∶1，V/ V）混合溶液溶解，制成烏頭堿、次烏頭堿質量濃度均為1 mg/mL 的混合對照品溶液。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法[6]試驗，吸取上述4 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇（8 ∶6 ∶1，V/ V/ V）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內20 min，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾[8]。詳見圖1 C。

圖1 薄層色譜圖1-3.test solution（batch numbers：20190607，20190608，20190609） 4.reference solution 5. reference material solution 6.negative reference solution A. Zanthoxylum nitidum B. Datura metel C. Radix Aconiti kusnezoffii Fig.1 TLC chromatograms

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge Phengl C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液-三乙胺（20 ∶80 ∶1，V / V / V）；檢測波長：271 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：取氯化兩面針堿對照品2.5 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加70%甲醇溶解并定容，搖勻，即得質量濃度為50 μg / mL 的對照品貯備液；精密量取1 mL，加70%甲醇溶解，并定容至10 mL，搖勻，即得氯化兩面針堿質量濃度為5 μg / mL 的對照品溶液。

供試品溶液：取樣品3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇20 mL 超聲處理30 min，濾過；濾渣和濾紙加70%甲醇20 mL 超聲處理30 min，放冷至室溫，濾過，濾液置同一容量瓶中，加70%甲醇洗滌3 次，洗液并入50 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

陰性對照品溶液：按止痛散處方和工藝制備缺毛兩面針的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2.2 項下對照品溶液、供試品溶液各適量，按選定色譜條件進樣測定，色譜圖見圖2。結果理論板數按氯化兩面針堿峰計應不低于2000，分離度均大于1.5，基線分離良好。

專屬性試驗：取上述對照品溶液、陰性對照溶液各適量，按選定色譜條件進樣測定，色譜圖見圖2。結果陰性對照品溶液在與氯化兩面針堿對照品溶液相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。

圖2 高效液相色譜圖1. nitidine chloride A. Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取對照品貯備液0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，置10 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，制成系列對照品溶液。取上述溶液各10 μL，按選定色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以氯化兩面針質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=55065.1X+5178.40（r=0.9996，n =6）。結果表明，氯化兩面針堿質量濃度在1.25 ～12.50 μg / mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取對照品溶液適量，按選定色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果氯化兩面針堿峰面積的RSD為0.68%（n =6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液（批號20190607）適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，10，12 h 時進樣測定，記錄峰面積。結果氯化兩面針堿峰面積的RSD為0.68%（n =6），表明供試品溶液在室溫放置12 h 內基本穩定。

重復性試驗：稱取樣品（批號20190608）適量，精密稱定，同法制備供試品溶液，再按選定色譜條件進樣測定6 次，記錄峰面積，并計算含量。結果氯化兩面針堿含量平均值為100.86 μg/g，RSD為1.16%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號20190608）2 g，精密稱定，共6 份，分別加入1，2，3 mL 的氯化兩面針堿對照品貯備液，同法制備供試品溶液，再按選定色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

樣品含量測定：取3 批樣品各適量，分別同法制備供試品溶液，再按選定色譜條件進樣測定，平行測定3 次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果見表2。

3 討論

3.1 樣品超聲提取次數選擇

在樣品提取預試驗中，考察了不同超聲提取次數對氯化兩面針堿含量的影響，結果超聲提取2 次與提取3 次的含量差異不大，故確定為2 次。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of recovery tests（n=9）

表2 樣品含量測定結果（n=3）Tab.2 Results of content determination of samples（n=3）

3.2 TLC 鑒別條件選擇

在毛兩面針的TLC 鑒別中，曾參考文獻[4， 10-11]選擇展開劑，結果發現各斑點分離效果不佳，拖尾嚴重，效果不理想。后參考文獻[7]，以二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（10 ∶2.5 ∶2.5 ∶0.5 ∶0.05，V/ V/ V/ V/ V）為展開劑，結果各斑點顯示清晰，分離度好。在洋金花的TLC 鑒別中，曾考察了乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（17 ∶2 ∶1，V/ V/ V）及氯仿-甲醇-濃氨試液（20 ∶3.5 ∶0.5，V/ V/ V），結果以后者為展開劑，各斑點分離度好，且顯色清晰，陰性對照無干擾。

在草烏TLC 鑒別中，曾考察了正己烷-乙酸乙酯-甲醇（8 ∶6 ∶1，V/ V/ V），乙酸乙酯-濃氨試液（20 ∶1，V / V）及乙酸乙酯-正己烷-濃氨試液（15 ∶5 ∶1，V/ V/ V），結果以正己烷-乙酸乙酯-甲醇（8 ∶6 ∶1，V/ V/ V）為展開劑時，各斑點分離度好，且顯色清晰，陰性對照無干擾。

3.3 含量測定指標選擇

氯化兩面針堿是毛兩面針的主要活性成分之一，具有抗炎、抗菌、鎮痛、抗腫瘤活性[12-15]，含量測定方法較成熟[4，16-17]，本試驗中結合瑤藥止痛方的臨床療效及對療效的貢獻程度，最終確定以氯化兩面針堿為考察指標。選用乙腈-0.2%磷酸溶液-三乙胺（20 ∶80 ∶1，V/ V/ V）為流動相，結果精密度、重復性、穩定性的RSD均小于2.0%，3 批樣品中氯化兩面針堿的平均含量為100.86 μg/g，平均加樣回收率為100.28%，RSD為1.75% （n=6），表明該研究所建立的標準可用于瑤藥止痛散的質量控制。