白樺茸不同提取物對小鼠急性毒性實驗研究

李建華，趙良友，張 娜，劉成臻，劉樹民

（1.中國輻射防護研究院，太原 030000，2.黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心，哈爾濱 150040）

白樺茸（Betulaplatyphylla），屬于多孔菌科纖孔菌屬，菌核呈現瘤狀，外表黑灰，有不規則溝痕，內部黃色，較硬。研究[1]表明，白樺茸在癌癥、糖尿病、心臟病和胃腸道疾病等方面有很好的療效。白樺茸主要活性物質包括白樺茸多糖、白樺茸黃酮、白樺茸三萜類物質等[2]。本實驗對白樺茸水提物、白樺茸發酵液、白樺茸醇提物進行小鼠急性毒性實驗，并測定白樺茸醇提物對小鼠的LD50，為白樺茸保健品的研發及臨床使用提供可靠的保證。

1 材料與方法

1.1 藥材

大興安嶺白樺茸（Betulaplatyphylla）購自黑龍江省藥材公司，經黑龍江中醫藥大學中藥資源與開發教研室王振月教授鑒定為真菌門擔子菌亞門層菌綱非褐菌目多孔菌科褐臥孔菌屬白樺茸。

1.2 動物

18～22gSPF級ICR小鼠140只，雌雄各半，黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（黑）2018-003，飼養于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，室內溫度20～25℃，相對濕度40%～60%。

1.3 試劑、儀器與設備

甲醇（天津市恒興化學試劑制造有限公司），甲醛（天津市天力化學試劑有限公司），無水乙醇（天津市恒興化學試劑制造有限公司），95%乙醇（天津市恒興化學試劑制造有限公司），伊紅（江蘇世泰實驗器材有限公司），蘇木素（江蘇世泰實驗器材有限公司），二甲苯（天津市天力士化學試劑有限公司）。凍干機（北京松源華興科技發展有限公司），AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），脫水機（LEICA-ASP300S），包 埋 機（LEICA-EG1150H），切 片 機（LEICARM2255），染色機（LEICA-ST5010），生物顯微鏡（OLYMPUS-CX31）。

1.4 實驗方法

1.4.1白樺茸不同提物的制備

1.4.1.1白樺茸水提物的制備 白樺茸在純凈水溶液中經83℃提取3.4h，料液比1:36（w/v），提取4次，通過熱水浸提的方式得到白樺茸水提物，其中1g水提物相當于4.5g白樺茸[3]。

1.4.1.2白樺茸發酵液的制備 采用20L全自動小型發酵罐進行樺褐孔菌液體發酵，培養基配方：1%玉米淀粉，2%葡萄糖，0.2%蛋白脈，0.1% KH2PO4,0.05% MgSO4。實消冷卻后接入樺褐孔菌液體菌種（采用PDA加富培養基200mL，分裝于500mL三角瓶中，重復5次后封口，120℃高壓滅菌30min。冷卻后將樺褐孔菌菌種塊接入液體培養基中，27℃，200r·min-1，培養96h），接種量為10%，27℃，20r·min-1，培養8d后，將發酵液pH調至11～12，在100℃條件下提取lh，過濾菌球，取濃縮液加入85%乙醇中進行醇沉，靜置24h后，取上清液至旋轉蒸發儀濃縮回收乙醇，離心后的沉淀冷凍干燥，稱質量[4-5]。

1.4.1.3白樺茸醇提物的制備 白樺茸在30%乙醇溶液中經85℃提取4h，料液比1:30（w/v），提取2次，通過水浴回流裝置得到白樺茸醇提物，將2次得到的白樺茸醇提物混合，利用旋轉蒸發儀回收溶劑，得到濃縮液利用凍干機48h后得到凍干粉。其中1g提取物相當于10g白樺茸。

1.4.2小鼠經口急性毒性預實驗 實驗選取SPF級ICR小鼠60只，體質量（20±2）g，雌雄各半，實驗前禁食12h，將白樺茸水提物、白樺茸發酵液和白樺茸醇提物按照小鼠最大體積0.4mL·10g-1單次經口給藥，觀察記錄小鼠死亡情況，根據小鼠給藥后的狀態和死亡數，來調節給藥劑量，找出各組小鼠全死亡和全不死亡的劑量，并根據預實驗結果進行正式實驗[6]。

1.4.3小鼠經口急性毒性實驗 根據預實驗的結果，選取SPF級ICR小鼠80只，體質量（20±2）g，隨機分成8組，分別為對照組、白樺茸水提物最大給藥濃度組、白樺茸發酵液最大給藥濃度組和白樺茸醇提物組（采用Bliss法，按照0.7倍劑量間距，將小鼠分為4.0、5.6、8.0、11.2、16.0g·kg-1·BW5個劑量組），每組10只，雌雄各半，馴化飼養3d，實驗前小鼠禁食不禁水12h，經口單次予白樺茸不同提取物，對照組予等量的純凈水，灌胃3h后自由進食[7-8]。

1.4.4觀察檢測 給藥后，觀察內容包括動物運動情況、眼瞼指征、呼吸、皮毛、排泄物和分泌物等。記錄動物中毒癥狀及中毒反應的起始時間、嚴重程度、持續時間等。實驗期間各組動物的死亡情況并詳細登記，出現死亡或瀕死動物及時進行解剖檢查。體質量指標，實驗期間稱量小鼠給藥第1天、第3天、第7天、第14天的體質量。檢測臟器系數和主要臟器的病理檢查，小鼠解剖時，觀察臟器色澤、體積、質地等變化；將心、肝、脾、肺、腎臟和腦于10%福爾馬林固定，修塊、脫水、包埋、切片、HE染色、封片，顯微鏡下觀察組織器官的組織結構和細胞形態。

1.5 統計學方法

體質量采用Excel進行統計，實驗結果均以均數±標準差（±s）表示，采用DAS軟件計算LD50和LD50的95%的可信限和回歸方程。

2 結果

2.1 預實驗結果

白樺茸水提物組，通過予小鼠白樺茸水提物最大給藥濃度（10g·kg-1），觀察14d后，未發現小鼠死亡。白樺茸發酵液組，通過予小鼠白樺茸發酵液最大給藥濃度（8g·kg-1），給藥后發現小鼠活動減少，次日小鼠恢復正常狀態，觀察14d后無小鼠死亡。白樺茸醇提物組，發現通過予小鼠不同劑量的白樺茸醇提物，小鼠全部死亡的劑量為16.0g·kg-1，全不死亡的劑量為4.0g·kg-1。根據預實驗結果，予小鼠白樺茸水提物最大給藥濃度（10g·kg-1），予小鼠白樺茸發酵液最大給藥濃度（8g·kg-1），予小鼠白樺茸醇提物采用Bliss法，按照0.7倍劑量間距，將小鼠分為4.0、5.6、8.0、11.2、16.0g·kg-1·BW5個劑量組，測LD50。

2.2 正式實驗結果

各組給藥后發現，對照組無異常，小鼠予白樺茸水提物后，給藥當日部分小鼠活動減少，給藥次日發現少數小鼠有稀便，持續觀察至第3天小鼠恢復正常，至觀察期結束未發現小鼠死亡；小鼠予白樺茸發酵液后，給藥當日雄性和雌性各有2只小鼠活動減少，持續觀察至第3天小鼠恢復正常，至觀察期結束未發現小鼠死亡；小鼠予白樺茸醇提物后，給藥當日小鼠活動減少，16.0g·kg-1劑量組小鼠給藥后60min，4只雌性和3只雄性小鼠出現呼吸急促、腹式呼吸，持續1min后死亡，給藥后75min剩余3只小鼠出現同樣癥狀，持續一段時間后死亡，11.2 g·kg-1劑量組小鼠給藥3h后，2只雌性和2只雄性小鼠呼吸急促，持續一段時間后死亡，剩余存活小鼠至觀察期結束未死亡，8.0g·kg-1劑量組小鼠給藥次日，發現有1只雌性和1只雄性小鼠死亡，5.6g·kg-1劑量組小鼠觀察至給藥后第3天，1只雌性小鼠死亡，4.0g·kg-1劑量組小鼠至觀察期結束，小鼠未發現異常狀態，未發生死亡。實驗觀察期間，對所有死亡小鼠及時解剖，部分小鼠腸有脹氣現象，未發現臟器有質地、色澤等改變，剩余存活小鼠至觀察期結束麻醉后剖檢，小鼠皮毛、分泌物等未見異常，解剖觀察臟器未見異常。小鼠急性毒性實驗情況，見表1，表2。采用DAS1.0軟件，根據小鼠予白樺茸醇提物死亡情況計算，LD50為10.399g·kg-1，LD50的平均可信限（ML95）為1.735，LD50的95%可信限（L95）為8.808～12.278g·kg-1，LD50的平均可信限率（L95%）為0.167，斜率（b）為6.622，Sb為1.635，X50為1.017，Sx50為0.037，回歸方程為Y（幾率單位）=-1.735+6.622×log（D）。

表1 雌性小鼠急性毒性實驗情況表 只

表2 雄性小鼠急性毒性實驗情況表

2.3 各組小鼠體質量變化指標檢測

小鼠急性毒性實驗中，馴化飼養3d小鼠體質量平穩，給藥時小鼠初始體質量在22～24g，記錄小鼠1、3、7、14d的體質量，各給藥組與對照組比較，小鼠予白樺茸水提物組的體質量至3d時，體質量呈下降趨勢，至7d和14d體質量與對照組相同呈上升趨勢；小鼠予白樺茸發酵液組體質量至3d時，體質量呈下降趨勢，至7d和14d體質量呈上升趨勢；小鼠予白樺茸醇提物各組小鼠體質量至3d，體質量呈下降趨勢，至7d，小鼠予白樺茸醇提物4.0、5.6組小鼠體質量逐漸恢復，小鼠予白樺茸醇提物8.0、11.2組小鼠體質量呈下降趨勢，至14d，小鼠予白樺茸醇提物4.0、5.6組小鼠體質量呈上升趨勢，小鼠予白樺茸醇提物8.0、11.2組小鼠體質量略有上升。說明白樺茸水提物和白樺茸發酵液單次灌胃予小鼠后，未影響小鼠的生長，白樺茸醇提物單次灌胃予小鼠后，對小鼠的生長有一定的影響，見表3，表4。

表3 雌性小鼠體質量變化情況 g

表4 雄性小鼠體質量變化情況 g

2.4 小鼠臟器指數變化情況

小鼠臟器系數是臟器的重量與自身重量的比值，能初步反映小鼠整體營養狀態和病變情況，各給藥組小鼠臟器指數結果與對照組相比無統計學意義（P＞0.05），見表5，表6。初步判定不會對小鼠造成臟器的損傷。

表5 雌性小鼠臟器指數變化情況

表6 雄性小鼠臟器指數變化情況

2.5 小鼠主要臟器形態學檢查情況

通過對照組與白樺茸醇提物11.2g·kg-1組的心、肝、脾、肺、腎臟和大腦的組織病理觀察，白樺茸醇提物組小鼠肝臟與對照組相比偶見肝細胞散在性腫大及核濃縮，其他臟器未發現形態學上的改變。見圖1。

圖1 小鼠主要臟器形態學情況（HE染色，×10）

3 討論

白樺茸不同提取物小鼠單次經口急性毒性實驗研究發現，小鼠予白樺茸水提物未發生死亡，個別小鼠有稀便現象和體質量輕微下降的趨勢，可能與給予白樺茸水提物后影響小鼠腸蠕動有關，次日恢復且體質量呈平穩上升趨勢，病理解剖觀察無異常，結果表明白樺茸水提物最大耐受劑量不低于10.0g·kg-1；小鼠予白樺茸發酵液未發生死亡，在給藥后小鼠活動減少和體質量有輕微的下降趨勢，可能因為小鼠受到藥物刺激的原因，次日逐漸恢復且體質量呈平穩上升趨勢，病理解剖觀察無異常，結果說明白樺茸發酵液最大耐受劑量不低于8.0g·kg-1；小鼠予不同濃度的白樺茸醇提物有不同程度的死亡，實驗結果發現隨著給藥濃度的升高小鼠死亡的數量有升高的趨勢，死亡的時間有縮短的趨勢，小鼠死亡前呼吸急促、腹式呼吸，死亡后解剖觀察組織器官，發現小鼠發生死亡可能與小鼠腸脹氣有關，經計算白樺茸醇提物小鼠經口急性毒性LD50為10.399g·kg-1，LD50的95%可信限（L95）為8.808～12.278g·kg-1，各給藥組小鼠的體質量均有不同程度下降，說明白樺茸醇提物對小鼠具有一定的毒性，并在組織病理形態學的觀察發現少數小鼠肝臟偶見病變，可能白樺茸醇提物對肝臟有一定毒性。

組織病理學可以通過形態學的改變來確定藥物毒性作用的靶器官，本研究主要對小鼠的心、肝、脾、肺、腎臟和大腦進行HE染色，在顯微鏡下觀察未發現有極顯著形態學的改變，可能與單次給藥和給藥周期過短有關，所以仍無法確定其靶器官，后期可以開展長期的毒性實驗，對其臟器進行組織病理檢查，確定白樺茸醇提物毒性作用的靶器官，并聯合代謝組學技術、基因組學技術等對白樺茸醇提物的毒性機制進一步的探討，為白樺茸的研發和臨床使用提供可靠的保證。