miR-383靶向Notch1對結腸癌HCT116細胞增殖和遷移的影響

王曉元 趙軼峰 楊永江 黃 迪 蘇卓彬 李 坤 李晶晶 李曙光

結腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，復發和轉移是結腸癌患者的主要死因[1]。目前臨床上常用的結腸癌治療方法主要是手術切除、放射治療和化學治療[2]。近年來隨著對結腸癌發病機制的深入研究，有望通過調控抑癌基因或促癌基因來影響結腸癌的發生、發展，為改善療效和患者的預后提供新的思路和靶點[3]。

Notch1在包括中樞神經系統在內的細胞和組織發育過程中起著重要作用。近年來研究表明，Notch1與包括結腸癌在內的多種腫瘤的發生、發展聯系緊密。Ishiguro等[4]的研究發現，結腸癌組織中Notch1可激活Wnt/β-catenin信號通路促進細胞增殖。

微RNA(miRNA)是非編碼RNA家族的一員，miRNA的發現為探究疾病發生的分子機制提供了新的方向。眾多研究表明miRNA可通過靶向癌基因、抑癌基因或其他與腫瘤細胞増殖、血管生成及腫瘤細胞凋亡相關的基因，對腫瘤的發生、發展進行調控。結腸癌患者存在多種miRNA的異常表達，如Eldaly等[5]發現miR-576-3p、miR-613在結腸癌患者血清中表達降低；Yan等[6]發現miR-182-5p可通過調控血管內皮生長因子-C(VEGF-C)抑制結腸癌的發生、血管生成和淋巴管生成。前期研究經軟件預測得知Notch1可能是miR-383的潛在靶基因，有研究顯示上調miR-383表達可抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[7]，但具體機制尚未明確。本研究觀察了miR-383對結腸癌細胞生物學行為的影響，并分析了在此過程中Notch1所起的作用，以期揭示miR-383在結腸癌中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2017年4月至2020年3月在河北北方學院附屬第一醫院經病理檢查確診為結腸癌的74例患者，收集其經手術切除的腫瘤組織及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>3 cm)。所有患者術前均未接受放射治療或化學治療。BALB/c裸鼠由本院動物實驗中心提供。結腸癌細胞株HCT116購自中國科學院細胞庫，LipofectamineTM2000 試劑、逆轉錄定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒、BCA 蛋白質分析試劑盒、ECL檢測試劑盒均購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Transwell 小室購自美國Corning公司，抗體、CCK8檢測試劑盒均購自英國Abcam公司。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 結腸癌HCT116細胞培養 結腸癌HCT116細胞在添加10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養基中培養，并置于5%CO2、37 ℃的恒溫箱中。

1.2.2 結腸癌細胞HCT116轉染及分組 根據轉染試劑LipofectamineTM2000的說明書，待HCT116細胞生長融合度達80%時，將其分別轉染陰性對照(NC)、miR-383模擬物、Notch1及共轉染miR-383模擬物+Notch1，對應分為miR-NC組、miR-383 組、Notch1組及miR-383+Notch1組；另設一空白對照組。

1.2.3 生物信息學預測及雙熒光素酶報告基因實驗 利用TargetScan在線分析Notch1與miR-383靶向關系。構建野生型或突變型Notch1的報告基因載體，將miR-383與野生型或突變型Notch1的報告基因載體共轉染HCT116細胞。轉染24 h后，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.2.4 qRT-PCR檢測 使用TRIzol試劑從細胞系或組織中提取總RNA，采用逆轉錄試劑盒將提取的總RNA合成cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書進行PCR反應，miR-383 mRNA的表達水平以U6為內參，Notch1 mRNA的表達水平以GAPDH為內參，miR-383轉染組HCT116細胞中及結腸癌組織中的Notch1 mRNA相對表達量采用2-△△Ct表示。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 Western Blot檢測 提取HCT116細胞或結腸癌組織蛋白，測定蛋白水平，采用12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。加入一抗Notch1抗體及內參GAPDH，4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h。ECL液暗室發光顯影，采集圖像并分析。

1.2.6 免疫組織化學檢測 石蠟切片置于65 ℃烤箱中過夜，梯度脫蠟、水化。加入3% H2O2溶液室溫孵育15 min，以阻斷內源性過氧化物酶活性。使用微波加熱法修復抗原。加入5%正常羊血清封閉，37 ℃孵育15 min。加入一抗Notch1抗體或Ki67抗體，4 ℃過夜。加入辣根過氧化物酶標記的兔二抗，37 ℃孵育30 min。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min。采用DAB顯色后，蘇木素染液染色2 min，隨后脫水，中性樹脂封片。采用正置顯微鏡放大500倍觀察切片。

1.2.7 CCK8法檢測 用CCK8試劑檢測各組HCT116細胞的增殖能力。HCT116細胞以1×103個/孔的密度接種在96孔板，培養24 h后，向每孔加入10 μL CCK8，然后用酶標儀測定450 nm處的吸光度值。

1.2.8 Transwell遷移實驗 調整HCT116細胞密度為1×106個/mL。在上室加入100 μL細胞懸液，在下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。取出小室后用PBS淋洗3次，將小室置于95%乙醇中固定5 min，在0.5%結晶紫染液中染色10 min后，用PBS漂洗去除未結合細胞的染液。

1.2.9 結腸癌裸鼠移植瘤模型制備 選取BALB/c裸鼠6只，約5周齡，體質量13～17 g，飼養于22 ℃、40%～75%濕度、12 h晝夜交替循環條件下，自由獲取水和食物。將裸鼠隨機分為miR-NC模型組(n=3)和miR-383模型組(n=3)。HCT116細胞轉染miR-NC或miR-383模擬物后，配置成約1×107個/mL單細胞懸液，接種于裸鼠左側腋下處皮下(0.2 mL/只)，3周后采用頸椎脫臼法處死全部裸鼠，剝離瘤體，稱重，拍照，甲醛固定。

2 結果

2.1 miR-383與Notch1的調控關系

TargetScan生物信息學預測結果如圖1所示，Notch1的3′-非翻譯區(3′-UTR)序列上存在連續的miR-383結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-383組的Notch1野生型質粒熒光素酶活性較miR-NC組明顯降低(20.07±0.12比13.61±0.19，P<0.01)；miR-383組與miR-NC組的Notch1突變型質粒熒光素酶的活性無明顯差異(20.09±0.13比20.02±0.07，P>0.05)；見圖2。qRT-PCR檢測結果顯示，空白對照組與miR-NC組HCT116細胞中miR-383 mRNA相對表達水平差異無統計學意義(1.00±0.08比1.09±0.11，P>0.05)；與miR-NC組相比，miR-383組HCT116細胞中miR-383 mRNA的相對表達水平顯著升高(1.09±0.11比4.45±0.17，P<0.01)，表明miR-383模擬物轉染成功；隨后的qRT-PCR檢測發現，與miR-NC組相比，miR-383組HCT116細胞中Notch1 mRNA相對表達水平明顯降低(1.00±0.12比0.57±0.09，P<0.01)；Western Blot結果顯示，與miR-NC組相比，miR-383組HCT116細胞中Notch1蛋白表達水平明顯降低(1.00±0.21比0.41±0.04，P<0.01)；見圖3。上述結果表明miR-383通過直接靶向作用于Notch1，從而抑制其mRNA和蛋白的表達。

圖1 TargetScan軟件預測圖

注：與miR-NC組相比較，**P<0.01

注：與miR-NC組比較，**P<0.01

2.2 結腸癌組織與癌旁正常組織中Notch1表達的比較

采用免疫組織化學法檢測Notch1在結腸癌組織和癌旁正常組織中的表達水平，結果顯示結腸癌組織中Notch1蛋白的表達水平明顯高于癌旁正常組織，見圖4。qRT-PCR檢測結果顯示結腸癌組織中Notch1 mRNA相對表達水平較癌旁正常組織明顯升高(1.96±0.14比1.00±0.08，P<0.01)，Western blot結果顯示結腸癌組織中Notch1蛋白表達水平較癌旁正常組織明顯升高(1.97±0.05比1.00±0.12，P<0.01)，見圖5。

圖4 結腸癌組織與癌旁正常組織中Notch1蛋白表達的比較 蘇木素染色 ×500 A 癌旁正常組織 B 結腸癌組織

注：與癌旁正常組織比較，**P<0.01

2.3 miR-383和Notch1對結腸癌細胞增殖和遷移的影響

采用CCK8法檢測4組細胞轉染后的增殖情況，結果顯示，與miR-NC組相比，Notch1組細胞的增殖能力明顯增強(1.61±0.13比2.17±0.12)，miR-383組細胞的增殖能力明顯減弱(1.61±0.13比1.08±0.11)，miR-383+Notch1組細胞的增殖能力較miR-383組明顯增強(1.08±0.11比1.94±0.14)，差異均有統計學意義(P均<0.01)，見圖6。采用Tranwell實驗檢測4組細胞的遷移能力，結果顯示，與miR-NC組相比，Notch1組細胞的遷移能力增強，miR-383組細胞的遷移能力明顯減弱，miR-383+Notch1組細胞的遷移能力較miR-383組明顯增強，見圖7。上述結果表明，miR-383可抑制結腸癌細胞的增殖和遷移能力，過表達Notch1能逆轉這種抑制效果。

注：與miR-NC組比較，aP<0.01；與miR-NC組比較，bP<0.01；與miR-383組比較，cP<0.01

圖7 miR-383和Notch1對結腸癌細胞遷移的影響 結晶紫染色 ×400 A miR-NC組 B Notch1組 C miR-383組 D miR-383+Notch1組

2.4 miR-383在結腸癌移植瘤裸鼠模型中對腫瘤生長的影響

利用轉染了miR-NC或miR-383 模擬物的HCT116細胞構建結腸癌移植瘤裸鼠模型，21 d后剝離腫瘤并稱重，免疫組織化學檢測結果顯示，miR-383模型組腫瘤組織中Ki67和Notch1蛋白表達水平均明顯低于miR-NC模型組(圖8)。與miR-NC模型組相比，miR-383模型組的腫瘤體積明顯縮小，腫瘤體質量明顯降低(圖9)。Western Blot結果也顯示，與miR-NC模型組相比，miR-383模型組的Notch1蛋白表達明顯降低(圖10)。上述結果表明，在結腸癌移植瘤裸鼠模型中，miR-383通過靶向調控Notch1抑制結腸癌細胞的增殖和腫瘤的生長。

圖8 miR-383在結腸癌移植瘤裸鼠模型中對腫瘤生長的影響 蘇木素染色 ×500 A miR-NC模型組的Ki67蛋白表達 B miR-383模型組的Ki67蛋白表達 C miR-NC模型組的Notch1蛋白表達 D miR-383模型組的Notch1蛋白表達

圖9 兩組的腫瘤大體標本對比

圖10 兩組Notch1蛋白表達的比較

3 討論

結腸癌細胞的增殖能力較強，凋亡率較低，對化學治療、放射治療和生物治療的耐藥性較強，導致腫瘤惡性生長，切除后復發率較高[8-9]。研究已證實miRNA的異常表達可調控細胞凋亡和增殖等重要的生物學行為。Qu等[10]的研究發現miRNA-374b可通過調控LRH-1/Wnt信號，抑制結腸癌細胞的增殖和侵襲；Lu等[11]的研究發現miR-17-3P可通過靶向調控Par4影響結腸癌細胞的增殖；Feng等[12]的研究發現miR-590-3p可通過抑制WIF1和DKK1激活Wnt/β-catenin信號通路，促進結腸癌細胞增殖。但目前關于miR-383在結腸癌中作用機制的研究較少，有研究顯示miR-383可通過調控CREPT在結腸癌中發揮抑癌作用[13]。目前研究表明，一種miRNA可調控多種靶mRNA，而多種miRNA也可調控一種靶mRNA，從而構成了錯綜復雜的生物調控網絡。為了深入探究mR-383在結腸癌中的作用機制，本研究中CCK8和Tranwell實驗發現，在結腸癌HCT116細胞中轉染miR-383模擬物后，結腸癌細胞的增殖和遷移能力較miR-NC組均明顯減弱，表明miR-383可能具有抑制結腸癌細胞增殖和遷移的作用。

研究表明，miRNA在基因調控的過程中，通過調節靶基因的蛋白表達水平，廣泛參與各種生物過程和人類疾病的發生、發展，因此miRNA靶基因的鑒定成為破解miRNA生物學功能的主要手段[14-15]。為進一步分析miR-383在結腸癌中的作用，本研究采用TargetScan篩選miR-383的潛在靶基因，結果顯示miR-383在Notch1的3′-UTR上具有潛在的結合位點。采用雙熒光素酶報告基因實驗對該預測進行驗證，發現miR-383可與Notch1的3′-UTR互補結合。進一步的檢測結果顯示miR-383 模擬物可抑制Notch1 mRNA和蛋白的表達水平，表明miR-383能直接靶向作用于Notch1。

Notch1不僅對正常細胞的分化有重要作用，而且可作為促癌基因或抑癌基因，對一些腫瘤的發生、發展等生物過程也起著調控作用。Notch信號通路在許多惡性腫瘤中表達失調[16]，Zhang等[17]的研究發現Notch 信號通路的異常激活與結直腸癌的發生有關。本研究檢測了Notch1在結腸癌組織和癌旁正常組織中的表達水平，發現結腸癌組織中Notch1 mRNA和蛋白的表達水平均較癌旁正常組織明顯升高(P均<0.01)，提示Notch1異常表達可能與結腸癌關系密切，這與以往的研究結果類似。此外，本研究通過體外細胞實驗觀察Notch1對結腸癌細胞的影響，發現上調Notch1的表達水平能促進HCT116細胞的增殖和遷移，并且轉染miR-383模擬物的細胞過表達Notch1后，miR-383對細胞增殖和遷移的抑制效果會被逆轉，這提示Notch1是miR-383抑制結腸癌細胞生物學行為的重要靶點。Ki67是一種增殖細胞相關的核抗原可用于判斷腫瘤的惡性程度，Ki67水平越高，提示腫瘤細胞增殖越活躍，腫瘤生長越快。本研究發現，miR-383在結腸癌轉移瘤裸鼠模型中的作用與體外實驗結果一致，miR-383過表達的裸鼠腫瘤組織中Notch1蛋白的表達和腫瘤細胞增殖能力明顯低于miR-NC模型組，并且腫瘤的體積縮小，體質量也明顯降低，表明miR-383能抑制裸鼠腫瘤的生長。

綜上所述，本研究結果表明Notch1在結腸癌組織中高表達，并能促進結腸癌細胞的增殖和遷移。miR-383能通過負性調控其靶基因Notch1的表達發揮抑制結腸癌細胞生物學行為的作用，并可抑制結腸癌轉移瘤裸鼠模型的腫瘤生長。本研究揭示了miR-383在結腸癌中發揮著抑癌因子的作用，Notch1是其作用的關鍵靶點。