巴爾通體MALDI-TOF MS數據庫的建立與鑒定方法的評價

栗冬梅，徐愛玲，杜小莉，宋秀平，崔志剛，劉起勇

中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所/傳染病預防控制國家重點實驗室/感染性疾病診治協同創新中心，北京 102206

巴爾通體是一群寄生于哺乳動物體內的營養要求苛刻、革蘭染色陰性需氧桿菌，其宿主范圍廣泛、全球分布，部分種類對人和動物具有致病性，分類學上屬于α-變形菌綱、根瘤菌目、巴爾通體科。目前有37種(包括亞種)巴爾通體被正式命名，與其近源的致病菌有引起人布魯氏菌病的布魯氏菌和植物致病菌根癌土壤桿菌。巴爾通體侵襲哺乳動物，在其體內復制繁殖，可持續感染紅細胞形成菌血癥，通過動物間打斗、抓咬行為或者吸血節肢動物在宿主與宿主、宿主與人之間傳播[1]，引起貓抓病、戰壕熱、心內膜炎和卡瑞恩病等多系統疾病，臨床表現復雜多樣。巴爾通體是苛養菌，生長緩慢，生化反應不活潑、沒有特征性的菌落形態和染色鑒定方法，只能依靠DNA序列進行分類鑒定，增加了實驗室操作難度，使得診斷更為困難[2-3]。

質譜技術是20世紀發展起來的生物大分子分析技術，主要用于蛋白質、肽分子鑒定。近年，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOF MS)已廣泛應用于革蘭陰性/陽性菌、需氧/厭氧菌以及分枝桿菌、酵母菌和真菌的鑒定，成為微生物鑒定最成功的生物技術之一[4-5]。不同種屬微生物各自具有特定的蛋白質組成，經MALDI-TOF MS檢測可以獲得不同強度的質荷比(m/z)，形成肽/蛋白指紋質譜圖，與標準庫中的圖譜進行比對可以實現細菌的種屬鑒定。該技術操作簡單方便，鑒定準確快速，高通量和低成本也是其主要優勢，除了可鑒定常見細菌和真菌，還極大地提高了臨床微生物實驗室對苛養菌及分枝桿菌等難鑒定的病原微生物的識別效率和能力[6]，目前已快速成為臨床微生物實驗室常規配備的檢測技術[7-8]。

MALDI-TOF MS技術用于巴爾通體鑒定，無疑是其鑒定方法的重要補充和發展。到目前為止，國際上僅FOURNIER等[9]報道了應用17種、17株巴爾通體參考菌株和39株盲測菌株進行了有關巴爾通體質譜鑒定方法的研究。國內尚無對于巴爾通體質譜鑒定方法的研究，且進口和國產的微生物MALDI-TOF MS儀的數據庫中均無巴爾通體的參考質譜圖，在疾病預防控制系統和臨床實驗室均無法應用該技術進行巴爾通體鑒定，限制了該技術在巴爾通體相關疾病診斷和控制中的應用和發展。在本研究中，課題組應用21種、200株巴爾通體菌株，涵蓋了全部重要致病種，建成巴爾通體質譜鑒定基礎數據庫，并應用173株多宿主多地區來源的野生菌株對樣品處理方法和該數據庫進行測試，證實MALDI-TOF MS用于巴爾通體菌株鑒定準確、快速，適用于今后臨床微生物實驗室相關病原菌的檢測鑒定。

1 材料與方法

1.1實驗菌株 選取21種/亞種巴爾通體，包括漢賽巴爾通體、桿菌樣巴爾通體、五日熱巴爾通體、伊麗莎白巴爾通體、文森巴爾通體伯格霍夫亞種、格拉漢姆巴爾通體、科勒巴爾通體、克氏巴爾通體、道志巴爾通體、文森巴爾通體文森亞種、文森巴爾通體阿魯潘亞種、特利波契巴爾通體、日本巴爾通體、黑瞎子巴爾通體、昆州巴爾通體、森林巴爾通體、庫珀巴爾通體、非洲跳鼠巴爾通體、麗松鼠巴爾通體、泰勒巴爾通體和地松鼠巴爾通體，200株巴爾通體菌株用于建立MALDI-TOF MS標準數據庫(表1)。應用173株巴爾通體野生分離菌株用于驗證評價所建質譜數據庫和鑒定方法的可信度(表1)。這些菌株包含12株巴爾通體ATCC標準菌，其他為北京、山東、河南、青海、西藏和新疆等地的野生菌株，分別分離自貓、犬、獼猴和多種嚙齒動物。其他菌株包括牛種布魯氏菌人用疫苗株104M、犬種布魯氏菌RM6/66、根癌土壤桿菌ATCC33970、金黃色葡萄球菌ATCC29213和大腸埃希菌ATCC25922。本研究全部菌株由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供。

表1 用于建立和評價巴爾通體菌MALDI-TOF MS數據庫的菌株信息

1.2儀器與試劑 Autof ms1000全自動微生物質譜檢測系統(鄭州安圖實驗儀器有限公司)、371型CO2培養箱(Thermo公司)、NU-425-600E生物安全柜(Nuaire公司)、LabCycler PCR儀(SensoQuest公司)、臺式離心機(Sigma公司1-14型)、胰酶大豆瓊脂(BD公司)、三氟乙酸(質譜級，Fluka公司)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA，質譜級，Sigma公司)，質譜樣本預處理試劑盒(包括裂解液1、裂解液2、緩沖液和基質)、微生物質譜鑒定儀用校準品和樣品靶板(鄭州安圖實驗儀器有限公司)，其中裂解液1、裂解液2和緩沖液分別為含甲酸、乙腈和三氟乙酸的溶液；基質溶液為α-氨基-4羥基肉桂酸(CHCA)的飽和溶液，在基質中加入裂解液2和緩沖液各60 μL充分混勻而成。

1.3方法

1.3.1巴爾通體菌株培養和鑒定 巴爾通體菌株在含有5%脫纖維羊血TSA上復蘇培養，置于37 ℃、5% CO2培養箱，潮濕環境中培養。桿菌樣巴爾通體在28 ℃條件下，用10%脫纖維羊血TSA培養。按菌落生長速度收獲培養第4～7天新鮮菌體。應用引物BhCS.781p-BhCS.1137n擴增巴爾通體屬的特異性基因枸櫞酸合酶基因(gltA)進行分類鑒定[10]。

1.3.2樣品預處理及靶板制備 在1.5 mL離心管中加入300 μL去離子水，取適量(5～10 mg)巴爾通體菌株新鮮培養物，漩渦震蕩，再加入900 μL無水乙醇充分混勻，檢測前置于-40 ℃保存。將上述含樣品的保存液10 000 r/min離心2 min，重復離心棄上清液，室溫干燥沉淀2～3 min，加50 μL裂解液1漩渦震蕩混勻，再加50 μL裂解液2混勻，10 000 r/min離心2 min，取1 μL上清液，滴加到樣品靶上，晾干至樣品點無明顯水跡，再取1 μL基質溶液(CHCA飽和溶液)覆蓋在樣品點上，晾干至樣品點無明顯水跡。

將同一菌株的樣品蛋白溶液滴加到8個不同靶位，同時選擇1個靶位滴加儀器校準品(圖1)，干燥后加基質溶液，結晶形成后放入質譜儀，每株菌建庫前先進行校準，再進行樣品質譜圖采集。校準峰值為3 637.772、4 365.343、5 096.776、5 381.446、6 255.444、7 274.467、10 300.032、13 683.173和16 952.332，按照儀器校準要求進行自動校準，達到4個峰值符合即為校準成功。

圖1 巴爾通體MALDI-TOF MS數據庫建庫靶板制備示意圖

1.3.3MALDI-TOF MS參數設置及數據采集 在Autof Acquirer軟件中選擇Microbe方法，線性正離子模式，加速電壓20 kV，激光源波長355 nm，延遲提取時間250 ns，相對激光強度為44%，頻率為60 Hz，累加數40，分子質量檢測范圍2 000～20 000，容差300 ppm；每個靶位采集3張譜圖，每張譜圖由3次累加組成，峰強度4 000～10 000，最終每個菌株獲得24張圖譜。在Autof Analyzer軟件中設置建庫參數，譜圖匹配容差200 ppm，最大峰數目70個。

1.3.4重復性驗證 選擇8種不同宿主、地域來源的巴爾通體，每種包含建庫菌株和測試菌株各1株進行MALDI-TOF MS鑒定的重復性實驗。每株菌每次采集6個重復靶點質譜得分，共計重復6次實驗。

1.3.5野生菌株實測 應用173株經測序鑒定為巴爾通體的菌株(表1)對所建立巴爾通體質譜數據庫進行驗證。每株用于驗證的菌株均采用直接涂抹法(簡稱“直涂法”)[6]和上述提取法準備樣品靶板，自動采集譜圖。直接涂抹法即用接種針挑取新鮮的單菌落1～2個，在靶板上涂抹均勻，干燥后覆蓋1 μL的基質溶液，晾干至樣品點無明顯水跡，將樣品靶放入質譜儀進行鑒定。依據系統自動搜庫結果進行判定，鑒定總分為10分，9.500～10.000分為精確鑒定，9.000～<9.500分為可靠鑒定，6.000～<9.000分為可參考鑒定，<6.000分為無效(不可靠)鑒定。用建庫相同的參數條件對細菌進行檢測，數據分析系統將會用分值的形式給出被測細菌與質譜庫中細菌的匹配情況。

1.3.6巴爾通體MALDI-TOF MS鑒定的特異性驗證 選用牛種布魯氏菌人用疫苗株104M、犬種布魯氏桿菌RM6/66、根癌土壤桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌各1株，對新建巴爾通體數據庫進行特異性驗證。每株菌每次鑒定時涂布6個重復靶點，采集6個重復靶點鑒定結果，觀察質譜得分及匹配情況。

1.4統計學處理 兩種樣品處理方法的質譜得分比較采用兩樣本Wilcoxon(Mann-Whitney)秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1巴爾通體MALDI-TOF MS數據庫建立 應用標準建庫方法采集了200株巴爾通體的蛋白指紋圖譜，包含漢賽、五日熱、桿菌樣和伊麗莎白巴爾通體等主要致病性巴爾通體，建立了擁有21種(包括3個亞種)巴爾通體MALDI-TOF MS數據庫。

這200株來自不同地區的巴爾通體菌株在種水平的主要離子峰一致，每株菌24次采集峰譜數據穩定，最終形成每個種的巴爾通體標準蛋白指紋圖譜，圖2以漢賽巴爾通體標準菌株為例展示單次質譜圖和24次疊加圖。建庫后，每株菌按照樣品模式進行譜圖采集打靶驗證，總得分為(9.631±0.156)分，得分范圍為9.019～9.863分(表2)，全部大于9.000分，屬于“可靠”或“精確鑒定”。

2.2不同樣品處理方法對巴爾通體MALDI-TOF MS鑒定結果的影響 應用2種不同方法處理60株(13種)巴爾通體菌株，質譜鑒定得分均大于9.000分，符合“可靠”或“精確鑒定”。乙醇-甲酸提取法處理細菌培養物再涂板，全部菌株得分為9.067～9.775分，直接涂靶得分為9.016～9.689分，準確率均為100%。兩種處理方法的質譜得分比較，差異有統計學意義(P<0.05),見表3。有44株乙醇-甲酸提取法處理后的菌株質譜得分高于直接涂靶法得分(圖3)。

注：縱坐標為樣品編號；橫坐標為差值(分)。

表3 不同樣品處理方法的巴爾通體MALDI-TOF MS鑒定結果(分)

續表3 不同樣品處理方法的巴爾通體MALDI-TOF MS鑒定結果

2.3重復性實驗 8種、16株巴爾通體菌株在各自的組內及組間重復實驗中質譜得分均>9.000分，均值為(9.078±0.031)～(9.776±0.006)分，均鑒定正確；組間CV值在0.06%～1.12%，實驗結果重復性好，質譜得分穩定(表4)。

表4 MALDI-TOF MS鑒定巴爾通體菌株的重復性

2.4巴爾通體MALDI-TOF MS數據庫驗證 將14種、173株巴爾通體菌株培養后用乙醇-甲酸提取法處理，基于新建的巴爾通體數據庫進行質譜鑒定。這173株菌已通過gltA基因擴增、測序鑒定到種水平。173株測試菌株全部鑒定到巴爾通體種水平，總得分為9.014～9.796分，平均(9.462±0.195)分，全部菌株得分均>9.000分(圖4)，準確率為100%。以菌株M59SHD為例，質譜鑒定結果前10位均為數據庫中的漢賽巴爾通體菌株，得分為9.505～9.642分，匹配最高分為ATCC標準菌株(圖5)。

圖4 173株巴爾通體測試菌株質譜得分圖

注：水平軸上下分別為測試菌株M59SHD和新建數據庫中漢賽巴爾通體的ATCC標準菌株。

2.5巴爾通體MALDI-TOF MS鑒定的特異性驗證 牛種布魯氏菌人用疫苗株104M的質譜得分為6.136～7.809分，平均(6.705±0.662)分，匹配第1位菌株為犬種布魯氏菌；犬種布魯氏菌RM6/66的質譜得分為6.162～7.633分，平均(7.104±0.592)分，匹配第1位菌株為犬種布魯氏菌；根癌土壤桿菌質譜得分結果為6.123～8.215分，平均(6.751±0.764)分，匹配第1位菌株為放射根瘤菌；金黃色葡萄球菌質譜得分為9.018～9.372分，平均(9.103±0.135)分，大腸埃希菌的質譜得分為9.214～9.598分，平均(9.453±0.135)分。在這5種細菌每個重復靶點的匹配結果中，前10位均未出現巴爾通體屬細菌。

3 討 論

MALDI-TOF MS無疑是近年在臨床實驗室應用于診斷感染性疾病最成功的生物化學技術之一。MALDI-TOF MS主要用來鑒定已培養出的細菌和真菌，某些生物樣品如尿液等不經培養簡單預處理后也可直接進行質譜檢測。從1975年ANHALT等[11]首次提出用質譜技術鑒定細菌，到1999年HOLLAND等[12]首次報道應用無須預處理的全菌蛋白進行質譜分析，實現了復雜技術簡單化、快速化和結果讀取“傻瓜化”的轉變，奠定了該技術快速普及的基礎。此后，大量相關研究陸續開展，并于21世紀開始將此項技術應用于臨床實驗室。FREIWALD等[13]的“細菌質譜系統發育分類和鑒定”的實驗手冊提供了詳盡的操作流程和說明，CLARK等[14]詳細綜述了MALDI-TOF MS用于各種革蘭陽性和陰性細菌、厭氧菌、苛養菌和各種真菌鑒定的研究，他們都指出這一技術將替代部分傳統方法，皆歸因于其特異、快速、穩定和低成本的優點。

操作簡便、快速和準確使得MALDI-TOF MS技術在臨床應用上很受歡迎，只需把菌培養出來，菌量無須過多、單個菌落即可，直接涂抹在靶面上，裝載到儀器中，簡單按幾次鼠標，1 min內結果就展示出來。對于巴爾通體這種苛養菌，沒有表型特征、沒有生化代謝特異反應，目前只能通過PCR測序進行鑒定，建立質譜鑒定方法將極大推動臨床實驗室對這類細菌的識別能力。

MALDI-TOF MS識別細菌體內穩定且豐富的核糖體蛋白，相對分子質量在2 000～20 000[15-16]，因此，相較于其他化學分類法如細胞壁脂肪酸法，不易受培養條件的影響，全菌蛋白質譜峰信號穩定，有利于鑒定和比較。依據常規方法，本課題組選取了統一培養條件下平板上穩定生長期的菌落，通常為培養4～6 d，但有些種類如桿菌樣巴爾通體生長更為緩慢，這也使得一切基于菌落培養的鑒定方法檢測速度降低，成為MALDI-TOF MS鑒定巴爾通體的限速步驟，也是該方法的局限性所在。不過一旦平板上開始出現菌落就可以快速完成鑒定。

對于一般生長在固體瓊脂平板上的細菌，直接涂靶是常規做法，有效地節省了中間步驟、試劑和操作過程中增加污染的可能性，是最簡單、快速有效的方法，在臨床實驗室中廣泛應用。但是，在某些細菌或特殊菌株的鑒定時，乙醇-甲酸或者乙酸-乙腈等提取法可以增加細菌蛋白的裂解質量，提高鑒定準確率[5]。巴爾通體菌落小但是形態多樣，有些干燥，有些向瓊脂平板下陷生長，還有些黏滑不易挑取，一次直涂操作不易成功，這種情況下采用提取法是較好的解決辦法。

準確的診斷要求鑒定方法的穩定性，除了穩定的設備、優化的實驗條件和良好的操作技術，MALDI-TOF MS技術對參考菌株庫的需求是這一技術的特點之一[17]。在MALDI-TOF MS微生物數據庫中不同來源的流行菌株越多，在臨床診斷中對未知菌株的命中率越高，否則可能因匹配得分低導致鑒定失敗。本課題組建立的巴爾通體MALDI-TOF MS數據庫菌種和菌株數量多、來源廣泛，不同來源地和不同宿主來源沒有影響巴爾通體在種屬水平上的準確鑒定。應用8種、16株巴爾通體進行的重復性實驗獲得良好測試效果，符合率達到100%，表明MALDI-TOF MS技術可以穩定、準確地在種水平鑒定巴爾通體。野生菌株的鑒定結果是評價數據庫質量最有說服力的數據，與FOURNIER等[9]的研究相比，本研究的建庫菌株不僅更多(21種/亞種vs. 17種，200株vs. 17株)，而且用于測試的野生菌株數量增加了4倍(173株vs. 39株)，可以更有效地驗證和評估所建巴爾通體質譜數據庫和技術方法的可靠性。經重復性實驗測試，質譜得分均>9.000分，CV值顯示組內和組間測量值變異非常小，實驗組內和組間上樣進行譜圖采集均不會影響鑒定結果，方法穩定。Autof ms1000全自動微生物質譜檢測系統中已有細菌4 000余種，沒有巴爾通體屬細菌。在建庫前，為觀察是否存在非特異性鑒定結果的情況，本課題組進行了巴爾通體菌株打靶搜庫，未發現非特異鑒定的高分結果，表明原始庫中4 000余種細菌對巴爾通體鑒定無干擾，不存在非特異性鑒定可能。進一步對近源菌包括布魯氏菌和根癌土壤桿菌的鑒定結果表明，用MALDI-TOF MS方法鑒定巴爾通體不會發生非特異性的識別錯誤，基于新建巴爾通體數據庫可以特異性地辨別巴爾通體屬細菌。限于巴爾通體菌種、菌株資源有限，本研究未能將目前已知的全部巴爾通體種類涵蓋進去，而且有些種類菌株數量較少，該數據庫并不完善，在未來使用過程中可能導致某些巴爾通體種類鑒定不到種水平，或者種水平鑒定錯誤。這種情況實際上是質譜技術用于細菌鑒定時的共同問題，這一局限性有待通過不斷向數據庫中補充菌種和菌株數據來解決。

本課題組完成了21種/亞種巴爾通體標準質譜圖，構建了巴爾通體標準質譜數據庫，可用于巴爾通體菌株的種屬水平鑒定。最后，為便于有關專業實驗室研究人員和臨床檢驗醫師參考和交流，筆者提出“巴爾通體質譜鑒定標準化操作流程”的建議，包括菌株分離培養、樣品處理和自動化質譜分析(圖6)。簡述如下，第1步：在37 ℃、5%CO2、濕度>70%培養條件下，復蘇培養巴爾通體菌株，4～6 d；第2步：直涂法或者乙醇-甲酸提取法制備質譜樣品，1～10 min；第3步：靶板上樣并裝載到質譜儀，3 min；第4步：設置參數、編輯樣品表單、采集圖譜鑒定并輸出結果，<1 min。

圖6 巴爾通體質譜鑒定標準化操作流程示意圖