PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA水平聯合檢測對早期胃癌的診斷價值

趙 勇，曾瑋榮，曾俊峰

武漢市第三醫院檢驗科，湖北武漢 430060

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一[1]。腫瘤患者的外周血單個核細胞(PBMCs)的基因表達譜與健康志愿者相比有明顯差異[2]。非結構蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9)在DNA復制過程中起DNA修復調節作用[3]。YUAN等[4]發現PBMCs中的NS5ATP9 mRNA水平和蛋白水平均顯著上調。白細胞介素-12p40(IL-12p40)是構成白細胞介素-12(IL-12)異源二聚體的兩條鏈之一[5]。白細胞介素1受體相關激酶1(IRAK-1)在啟動針對外來病原體的先天免疫應答中起關鍵作用[6]。SIEDLAR等[7]發現，在胃癌患者的PBMCs中IL-12p40和IRAK-1的mRNA水平受到明顯的抑制。然而，PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA水平聯合檢測對早期胃癌的診斷價值尚未見報道，故本研究對此進行了探討。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2017年11月至2019年11月本院收治的早期胃癌患者112例作為早期胃癌組；其中男55例、女57例，年齡37～79歲、平均(48.05±23.05)歲，腫瘤最大徑1.3～6.4 cm、平均(3.76±2.04)cm，TNM分期：Ⅰ期81例、Ⅱ期31例。將同期本院收治的胃部良性疾病患者112例作為良性組；其中男63例、女49例，年齡35～81歲、平均(46.39±21.04)歲，胃潰瘍54例、淺表性胃炎38例、萎縮性胃炎20例。112例早期胃癌患者和112例胃部良性疾病患者均經本院病理科證實。排除標準：(1)嚴重心、肝、腎功能損傷者；(2)長期使用皮質類固醇激素及免疫抑制劑者；(3)患有精神疾病者；(4)患有其他癌癥者。另外，將同期于本院進行體檢的體檢健康者112例作為對照組；其中男56例、女56例，年齡32～74歲、平均(45.70±19.97)歲。各組一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入研究者均簽署知情同意書。

1.2方法 抽取上述三組人群(早期胃癌和良性組患者于治療前)肘前靜脈血15 mL。使用北京綠源伯德生物科技有限公司的PBMC細胞提取試劑盒提取PBMCs,使用北京源暢致和生物科技有限公司的RNA提取試劑盒(RNAsimple總RNA提取試劑盒)進行總RNA抽取。使用微克特銳生物科技(武漢)有限公司的反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成。使用廣州鋮銨生物科技有限公司的SYBR green試劑和表1中的引物進行NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA相對水平檢測。所有反應一式三份，去掉極大值和極小值，以2-ΔΔCT進行mRNA相對水平的計算。

表1 NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的引物序列(5′-3′)

1.3統計學處理 SPSS22.0軟件進行統計分析，多組間比較采用one-way ANOVA檢驗，方差齊者采用t檢驗比較，方差不齊者采用Tamhane′T2法比較。應用受試者工作特征曲線(ROC曲線)下的面積(AUC)分析PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1檢測早期胃癌的臨床診斷價值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1三組間PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA相對水平的比較 三組間NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA相對水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 三組間PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA相對水平的比較

2.2三項PBMCs mRNA指標用于早期胃癌與胃部良性疾病鑒別診斷的效能 NS5ATP9的AUC為0.89(95%CI：0.85～0.94)，以0.939 7為診斷界值，靈敏度和特異度均為91%；IL-12p40的AUC為0.86(95%CI：0.81～0.91)，以0.119 8為診斷界值，靈敏度為87%，特異度為88%；IRAK-1的AUC為0.92(95%CI：0.88～0.97)，以2.095 0為診斷界值，靈敏度為93%，特異度為92%。見圖1、表3。

表3 三項PBMCs mRNA指標用于早期胃癌與胃部良性疾病鑒別診斷的效能

圖1 三項PBMCs mRNA指標用于早期胃癌與胃部良性疾病鑒別診斷的ROC曲線

2.3三項PBMCs mRNA指標用于區分早期胃癌患者與體檢健康者的診斷效能 NS5ATP9的AUC為0.95(95%CI：0.92～0.98)，以0.070 4為診斷界值，靈敏度、特異度分別為96%、94%；IL-12p40的AUC為0.91(95%CI：0.86～0.96)，以0.030 7為診斷界值，靈敏度、特異度分別為92%、91%；IRAK-1的AUC為0.96(95%CI：0.93～0.99)，以0.085 9為診斷界值，靈敏度和特異度均為95%。見圖2、表4。

表4 三項PBMCs mRNA指標用于區分早期胃癌患者與體檢健康者的診斷效能

圖2 三項PBMCs mRNA指標用于區分早期胃癌患者與體檢健康者的ROC曲線

2.4三項PBMCs mRNA指標對早期胃癌的聯合診斷結果 患有早期胃癌的為真陽性，未患有早期胃癌的為真陰性。NS5ATP9以0.939 7為診斷界值，IL-12p40以0.119 8為診斷界值，IRAK-1以2.095 0為診斷界值，三項均為陽性則聯合診斷陽性，反之則為聯合診斷陰性。三項PBMCs mRNA指標聯合診斷早期胃癌的靈敏度為92.86%(104/112)，特異度為93.30%(209/224)，準確度為93.15%(313/336)，見表5。

表5 三項PBMCs mRNA指標聯合對早期胃癌的診斷結果(n)

3 討 論

自2008年以來，胃癌已被列為全球第四大最常見的惡性腫瘤，每年估計有980 000例新病例和738 000例與癌癥相關的死亡病例[8]。胃癌的發病率因國家而異，東亞國家發病率最高。胃癌的預后很差，因為許多患者確診時已經為疾病晚期，沒有手術治愈的可能。因此，迫切需要開發新的生物標志物，特別是非侵入性的替代生物標志物，用于早期胃癌的診斷，從而改善預后。此外，篩選出可用于預測胃癌患者臨床結局的新型分子標志物也有助于制訂更好的治療策略來有效控制該疾病。盡管已有幾種腫瘤生物標志物，如癌胚抗原(CEA)和糖類抗原19-9(CA19-9)，用于胃癌的診斷或預后判斷，但均未顯示出理想的敏感性和/或特異性[9]。因此，迫切需要更特異、敏感的腫瘤生物標志物對早期胃癌進行診斷。本研究對早期胃癌組、良性組和對照組受試人員血液中PBMCs的NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA表達量進行了檢測，并通過ROC曲線分析，發現PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA的聯合檢測對早期胃癌診斷的靈敏度為92.86%，特異度為93.30%，準確度為93.15%。

PBMCs是免疫系統的重要組成部分，包括單核細胞、T細胞、B細胞和自然殺傷細胞。本研究中發現，早期胃癌患者、胃部良性疾病患者和體檢健康者PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA水平有明顯差異。與以前的血液中的標志物相比，PBMCs中的mRNA能夠更加穩定地存在[10]。PBMCs表達人類基因組編碼的大約80%的基因，這些基因對在宏觀和微觀環境中發生的機體變化做出響應[11]。近年來，人們越來越多地探索了它們在評估人體生物學狀態方面的用途。例如，已經證明PBMCs中基因表達的改變可反映人體的惡性腫瘤[12]。癌細胞與PBMCs之間的相互作用非常復雜，涉及免疫系統對腫瘤的識別和腫瘤對免疫系統的逃避。因此，本研究創新性地使用PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1 mRNA作為指標來評估其對早期胃癌的診斷價值。

NS5ATP9是一種相對分子質量為15×103的蛋白質，含有保守的增殖細胞核抗原(PCNA)結合基序[3]。NS5ATP9用于早期胃癌與胃部良性疾病鑒別診斷的靈敏度和特異度均為91%，用于區分早期胃癌患者與體檢健康者的靈敏度和特異度分別為96%和94%。NS5ATP9蛋白在許多不同類型的人類惡性腫瘤組織中過表達，包括肝細胞癌、乳腺癌、肺癌、腎上腺和胰腺腫瘤，表達水平與患者預后不良有關[13]。此外，體外研究表明NS5ATP9的過表達促進腫瘤細胞的生長，小干擾RNA引起的NS5ATP9的水平降低導致細胞活力的降低[14]，表明NS5ATP9在癌變和癌癥的發展中起著重要的作用。

IRAK-1是參與核因子κB(NFκB)/活化蛋白-1(AP-1)/促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)依賴性促炎蛋白合成的信號轉導關鍵激酶之一，特別是在脂多糖、脂肽、透明質酸、熱休克蛋白或壞死細胞等刺激單核細胞/巨噬細胞后[15]。本研究中用于早期胃癌與胃部良性疾病的鑒別診斷，IL-12p40、IRAK-1的靈敏度分別為87%、93%，特異度分別為88%、92%。用于區分早期胃癌患者與體檢健康者，IL-12p40、IRAK-1的靈敏度分別為92%、95%，特異度分別為91%、95%。由于IRAK-1是信號級聯反應中必不可少的分子，因此其下調會阻礙信號轉導及對腫瘤壞死因子(TNF)和IL-12p40生成的誘導作用[16]。用胰腺癌細胞刺激人單核細胞會導致IRAK-1蛋白表達的顯著抑制，這與腫瘤細胞再刺激后TNF和IL-12p40的生成減少有關，但與IL-10的生成無關[17]。因此，IRAK-1蛋白表達下調導致胃癌細胞逃避免疫監控，促進了胃癌的發展。

與周麗華等[18]報道的血清親環素B(CypB)76.36%的靈敏度，75.51%的特異度相比，PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1聯合對早期胃癌診斷的靈敏度為92.86%，特異度為93.30%，準確度為93.15%，具有較高的診斷價值。與劉云云等[19]報道的靛胭脂染色內鏡診斷早期胃癌相比，本研究的聯合診斷除了具有靈敏度和特異度的優勢外，還具有操作簡便的特點。

綜上所述，PBMCs中NS5ATP9、IL-12p40、IRAK-1的mRNA是早期胃癌診斷的潛在標志物。但本研究仍然有不足之處，如各組納入的樣本量較少，還需繼續增加樣本量并進一步地進行研究。