異型淋巴細(xì)胞比例聯(lián)合EB病毒抗體及核酸檢測(cè)在兒童傳染性單核細(xì)胞增多癥輔助診斷中的應(yīng)用

陳新敏，梁 華，郭 燕，何抒蔓,葉鑫梅，張躍川，蔣 康△

1.四川省婦幼保健院·成都醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都 610045;2.四川省雅安市石棉縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川雅安 625400

傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)是一種單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)增生性疾病，EB病毒(EBV)感染為其主要致病因素，兒童和青少年常見(jiàn)，臨床常出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹、咽峽炎、淋巴結(jié)腫大等非特異性表現(xiàn)，多數(shù)預(yù)后良好，部分患者可出現(xiàn)持續(xù)高熱、肝功受損等重癥表現(xiàn)[1]。由于IM發(fā)病隱匿，臨床表現(xiàn)多樣而復(fù)雜，臨床誤診率和漏診率較高[2]。因此，尋找用于IM早期診斷的更為靈敏而有效的方法顯得尤為重要。目前，異型淋巴細(xì)胞比例、EBV抗體及EBV核酸檢測(cè)等已在臨床實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。本研究旨在探討異型淋巴細(xì)胞比例、EBV抗體(VCA-IgM抗體)、EBV核酸(EBV-DNA)檢測(cè)聯(lián)合用于兒童IM診斷的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年4月至2020年3月于四川省婦幼保健院·成都醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院就診的兒童共185例。其中試驗(yàn)組85例，年齡2～10歲、平均(5.92±3.18)歲，男48例、女37例；試驗(yàn)組病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》第7版[3]關(guān)于兒童IM的診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診為IM的患兒；(2)無(wú)合并其他疾病；(3)無(wú)其他特殊用藥史。排除標(biāo)準(zhǔn)：病例資料不全，影響結(jié)果分析者。對(duì)照組為同期在該院進(jìn)行體檢的健康兒童，共100例，年齡1～10歲、平均(5.35±2.74)歲，男61例、女39例。本研究經(jīng)該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入研究者均知情同意。兩組研究對(duì)象的性別構(gòu)成、年齡、身高和體質(zhì)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 兩組間一般資料的比較

1.2方法

1.2.1異型淋巴細(xì)胞檢測(cè) 取適量血液制成涂片，瑞氏-吉姆薩染色，油鏡下鏡檢，分類100個(gè)白細(xì)胞，計(jì)算異型淋巴細(xì)胞比例。異型淋巴細(xì)胞的形態(tài)按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第四版)》[4]描述的形態(tài)進(jìn)行分類，判斷標(biāo)準(zhǔn)采用Downey分類方法，將異型淋巴細(xì)胞分為Ⅰ型(漿細(xì)胞型)、Ⅱ型(不規(guī)則型)和Ⅲ型(幼稚細(xì)胞型)。若異型淋巴細(xì)胞比例>10%，則判為陽(yáng)性。

1.2.2VCA-IgM抗體檢測(cè) 采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。采集未抗凝靜脈血3 mL，自然凝固后，以3 500 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，分離血清用于VCA-IgM抗體檢測(cè)。使用索林公司Liaison XL型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀及其配套試劑，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。本室參考范圍：<20 U/mL為陰性，20～40 U/mL為可疑，>40 U/mL為陽(yáng)性。

1.2.3EBV-DNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法進(jìn)行檢測(cè)。EDTA-K2抗凝血2 mL，采用EBV核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒(廣東中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。結(jié)果判定：測(cè)定值>1×103copy/mL判定為陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1異型淋巴細(xì)胞比例、VCA-IgM抗體及EBV-DNA的檢測(cè) 試驗(yàn)組兒童的異型淋巴細(xì)胞比例為(16.31±6.95)%，陽(yáng)性例數(shù)54例，而對(duì)照組兒童的異型淋巴細(xì)胞比例為(2.17±0.83)%，陽(yáng)性例數(shù)6例，兩組間陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。試驗(yàn)組VCA-IgM抗體和EBV-DNA檢測(cè)陽(yáng)性例數(shù)分別為69例和73例，與對(duì)照組相比較，陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 異型淋巴細(xì)胞比例、VCA-IgM抗體、EBV-DNA檢測(cè)結(jié)果

2.2異型淋巴細(xì)胞比例、VCA-IgM抗體及EBV-DNA單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)在兒童IM輔助診斷中的應(yīng)用 異型淋巴細(xì)胞比例、VCA-IgM抗體及EBV-DNA單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果顯示，3個(gè)項(xiàng)目聯(lián)合檢驗(yàn)的靈敏度為92.94%，高于3個(gè)項(xiàng)目單獨(dú)檢驗(yàn)的靈敏度，但特異度低于3個(gè)項(xiàng)目單獨(dú)檢驗(yàn)，見(jiàn)表3。

表3 異型淋巴細(xì)胞比例、VCA-IgM抗體、EBV-DNA單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果(%)

3 討 論

EBV是一種嗜淋巴細(xì)胞的雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒科，主要經(jīng)唾液傳播，人群中感染率超過(guò)95%。EBV感染后可在口腔咽部上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，引起呼吸道感染，并可長(zhǎng)期潛伏在淋巴組織中，因此，其感染具有增殖性和潛伏性的特點(diǎn)[5]。EBV不僅是引起IM的重要病原體，而且與某些淋巴系統(tǒng)相關(guān)的腫瘤，如伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、T/NK細(xì)胞淋巴瘤等的發(fā)生密切相關(guān)[6-7]。EBV感染后癥狀不典型，與其他呼吸道感染性疾病癥狀相似，臨床漏診率和誤診率均較高。

健康人體內(nèi)B淋巴細(xì)胞表面存在EBV受體，當(dāng)人體感染EBV，B淋巴細(xì)胞表面的EBV受體(CD21)，最先受攻擊，隨后激活T淋巴細(xì)胞，使細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞演變成異型淋巴細(xì)胞[8]。因此，異型淋巴細(xì)胞比例是臨床輔助診斷IM常用的檢測(cè)指標(biāo)之一，約80%的IM患者血清中可見(jiàn)異型淋巴細(xì)胞比例增高[9]。EBV感染后，異型淋巴細(xì)胞比例隨病程發(fā)展而變化，一般在發(fā)病初3～5 d出現(xiàn)，第7～10天達(dá)高峰后逐漸下降，持續(xù)2～8周。另外，因異型淋巴細(xì)胞由T淋巴細(xì)胞活化而來(lái)，在某種程度上反映了機(jī)體與病毒的相互作用，是臨床評(píng)價(jià)IM病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，IM患兒血清中異型淋巴細(xì)胞比例升高，為(16.31±6.95)%，陽(yáng)性率為63.53%，與對(duì)照組患兒相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這也與國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究結(jié)果相似[10]。因而，異型淋巴細(xì)胞比例可作為EBV感染所致的IM的輔助診斷指標(biāo)之一，其具有簡(jiǎn)單易行，低廉快捷，適用于基層醫(yī)院，但由于異型淋巴細(xì)胞的形態(tài)識(shí)別具有主觀性，檢測(cè)者辨識(shí)能力的差異等因素，導(dǎo)致異型淋巴細(xì)胞比例的檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性、可比性較差。隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)等檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，現(xiàn)已引入了EBV抗體及核酸檢測(cè)等方法用于臨床輔助診斷EBV感染所致的IM。

EBV感染機(jī)體后，B淋巴細(xì)胞可誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生一系列EBV抗體。原發(fā)性EBV感染時(shí)，機(jī)體首先產(chǎn)生對(duì)抗衣殼蛋白(CA)的IgM、IgG 抗體，即VCA-IgM、VCA-IgG抗體，其中VCA-IgM抗體最早出現(xiàn)，是急性感染期的可靠指標(biāo)，其在體內(nèi)持續(xù)1～2個(gè)月后逐漸消除，VCA-IgG抗體出現(xiàn)晚于VCA-IgM，急性感染晚期機(jī)體會(huì)出現(xiàn)抗早期抗原(EA)的抗體，恢復(fù)期會(huì)出現(xiàn)晚期抗核抗原(NA)的抗體，VCA-IgG、病毒中和抗體(VNA-IgG)在體內(nèi)會(huì)持續(xù)存在[11]。鑒于EBV潛伏感染的特點(diǎn)及機(jī)體抗體產(chǎn)生的規(guī)律，臨床上多以VCA-IgM陽(yáng)性作為EBV感染所致IM輔助診斷的依據(jù)。本研究采用血清VCA-IgM抗體檢測(cè)，研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，69例已確診為IM的患兒VCA-IgM抗體檢測(cè)為陽(yáng)性，有16例[18.82%(16/85)]的患兒抗體檢測(cè)為陰性，這與兒童免疫系統(tǒng)尚未完全發(fā)育或處于病毒感染初期，機(jī)體感染病毒后，無(wú)法產(chǎn)生抗體或抗體量太低，導(dǎo)致血清學(xué)檢測(cè)出現(xiàn)假陰性結(jié)果[12]。

隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，臨床現(xiàn)已引入了熒光定量PCR檢測(cè)EBV-DNA，通過(guò)定量檢測(cè)患兒血清EBV-DNA水平反映體內(nèi)病毒感染和復(fù)制情況[13]。該檢測(cè)項(xiàng)目對(duì)IM的輔助診斷和療效評(píng)估都具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，EBV-DNA檢測(cè)的陽(yáng)性率為85.88%，高于異型淋巴細(xì)胞比例和血清學(xué)抗體檢測(cè)陽(yáng)性率，這與CAO等[14]的研究結(jié)果相似。

由于IM起病隱匿，且與其他急性呼吸道感染性疾病的癥狀相似，臨床易出現(xiàn)漏診和誤診，因此有必要尋求針對(duì)兒童IM及時(shí)而有效的輔助診斷方法。目前，臨床常用異型淋巴細(xì)胞比例、EBV抗體及核酸檢測(cè)這3種檢測(cè)方法來(lái)輔助診斷IM。本研究結(jié)果顯示，3種方法聯(lián)合檢測(cè)診斷IM的靈敏度為92.94%，高于3種方法單獨(dú)檢測(cè)結(jié)果，與國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究結(jié)果較一致[15]。

因此，有條件的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)將異型淋巴細(xì)胞比例、VCA-IgM抗體檢測(cè)及EBV-DNA檢測(cè)3個(gè)項(xiàng)目均開(kāi)展，并進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，以提高輔助診斷IM的靈敏度，彌補(bǔ)單項(xiàng)試驗(yàn)的不足，降低漏診率和誤診率。