小麥WOX轉錄因子基因的全基因組鑒定與分析

武強強，張鳳潔，董浩歡，盧 平，樊 婕，李雪垠，王愛萍，董 琦*

（山西農業大學 a. 農學院，太谷 030801；b. 生命科學學院，太谷 030801）

小麥是一種在我國被廣泛種植的谷類作物，其代表種普通小麥（Triticum aestivumL.）是禾本科植物。小麥的常見種在中國還包括提莫非維小麥、一粒小麥、圓錐小麥。小麥是異源六倍體植物（2n=6x=42），有A、B、D 3個基因組，它的基因組龐大（高達17 Gb）且含有大量重復序列。目前小麥的全基因組測序已經完成［1-3］。小麥的種植面積約占世界總耕作面積的17%，提供了全世界約20%的糧食消耗［4］。小麥面粉富含蛋白質、脂質、碳水化合物、礦物質和維生素A等人體必需的營養物質［5］。小麥作為世界上糧食消費最大的產品之一，對保證全世界人類和動物的營養健康有十分重要的作用。因此，對小麥的基礎研究一直是植物科學家們關注的重點。

轉錄因子（transcription factor，TF）也稱為反式作用因子，是指能夠與真核基因啟動子區域中的順式作用元件發生特異性結合，并對下游靶基因的轉錄有調控作用的一種DNA結合蛋白［6］。轉錄因子具有特定DNA序列的結合活性，能保證靶基因在特定時間和空間以特定強度表達。轉錄因子作為植物中重要的調控蛋白質，可以調控植物生長發育和對脅迫的應答反應，幾乎參與到植物所有的生長發育過程［7］。

2004年，Haecher等［8］在對擬南芥基因組進行全面研究分析后，發現了15個與WUS（WUSCHEL）結構相似的編碼蛋白質的基因，并將它們命名為WOX基因。WUSCHEL-related homeobox（WOX）轉錄因子家族是植物特有的一類基因轉錄因子。WOX基因家族的功能涉及植物胚胎發育、干細胞維持和器官形成等關鍵過程，這些功能的發揮與它們可以促進細胞分裂或阻止未成熟細胞的提前分化密不可分［9-10］。小麥WOX轉錄因子都包含一個非常保守的由65個氨基酸殘基組成的DNA結合同源異型結構域（homeodomain，HD），此結構域在WOX轉錄因子的功能中起著關鍵作用［11］。隨著大量植物基因組測序的相繼完成，擬南芥、楊樹、水稻、高粱、玉米和茄子中的WOX基因已全部鑒定完成［12-14］，但小麥中WOX基因全基因組的鑒定與分析還不全面。鑒定和分析WOX轉錄因子基因家族是進一步研究WOX基因功能的重要基礎。

本研究運用生物信息學技術手段對普通小麥的WOX基因進行了全基因組鑒定、系統發育樹構建、序列分析，為進一步探討WOX基因調控小麥生長發育的分子作用機理奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 小麥WOX基因鑒定及蛋白質理化性質分析

從PlantTFDB V4.0數據庫（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）下載小麥全部WOX基因家族成員［15］。利用Phytozome數據庫（V12，https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）檢索小麥WOX基因的序列信息。利用在線工具ExPASy-Compute pI/Mw（https://web.expasy.org/compute_pi/，https://web.expasy.org/protparam）對小麥WOX基因編碼的蛋白質序列的等電點和分子量進行預測和分析［16］。

1.2 小麥WOX基因系統發育樹的構建及基因結構分析

利用Clustal X2軟件對小麥WOX基因家族成員的蛋白質序列進行多重序列比對［17］。利用MEGA 5.0軟件和鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構建系統發育樹（bootstrap replications設置為1 000）［18］。利用GSDS 2.0 在線分析軟件（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析小麥WOX基因的結構［19］。

1.3 小麥WOX基因的蛋白質基序檢索和順式作用元件分析

從Phytozome數據庫下載所有小麥WOX基因家族成員的蛋白質序列，以小麥WOX基因上游1.5 kb序列作為啟動子序列。利用序列保守基序識別工具MEME（Multiple Em for Motif Elicitation，Version 5.0.3，http://meme-suite.org/tools/meme）鑒定小麥WOX基 因 的 蛋 白 質 基 序［20］。以 PlantCARE 在線分析軟件（Plant Cis-Acting Regulatory Elements，http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）鑒定小麥WOX基因上游1.5 kb啟動子區域內的順式作用元件［21］。

1.4 小麥WOX基因組織特異性與環境誘導表達分析

將小麥WOX基因序列提交到WheatExp數據庫（https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/），下載小麥WOX基因在不同組織和不同逆境條件下的基因表達量數據［22］。利用TBtools工具中HeatMap繪制基因表達熱圖［23］。

2 結果與分析

2.1 小麥WOX基因鑒定及蛋白質理化性質

基于PlantTFDB V4.0數據庫，小麥基因組共有20個WOX轉錄因子家族基因。根據它們在小麥染色體上的定位情況，把它們分別依次命名為TaWOX1～TaWOX20。利用 ExPASy軟件（http://expasy.org）對所有預測的小麥WOX家族成員氨基酸序列進行分子量和等電點的分析，這20個WOX基因的基本信息如表1所示。它們分布在1A～5A、1B、2B、4B、1D～5D染色體上，長度在199～3 694 bp，Ta-WOX20的編碼序列（coding sequence，CDS）最長，其蛋白質有322個氨基酸殘基，TaWOX9的CDS序列最短，其蛋白質有66個氨基酸殘基。

表1 小麥WOX基因基本信息及蛋白質理化性質Tab. 1 Basic information of WOX genes and physicochemical properties of proteins in wheat

2.2 小麥WOX轉錄因子家族系統進化關系和基因結構

小麥WOX轉錄因子家族成員系統發育樹如圖1所示。小麥WOX蛋白質在系統發育樹中都是成對出現的，如TaWOX4/TaWOX3等。小麥的20個WOX蛋白質可以劃分為3個亞族，不同亞族的親緣關系較遠，同一亞族的親緣關系較近，由此推測小麥WOX轉錄因子基因家族在其漫長的演化過程中可能發生了一些適應性變異。基因結構分析顯示，所有的基因都含有外顯子和內含子結構，有些基因呈現出斷裂基因的特征，如TaWOX5、TaWOX6、TaWOX8均含有3個外顯子，所有的基因中以Ta-WOX9最為特殊，其結構最簡單，僅含有1個外顯子。

2.3 小麥WOX轉錄因子家族保守基序分析

蛋白質保守基序分析顯示，小麥20個WOX蛋白質中共有10個保守基序，分別將其命名為 Motif 1～Motif 10（圖2）。TaWOX9僅含有Motif 1 1個基序，而TaWOX2序列不包含任一基序。其中Motif 1存在于除TaWOX2、TaWOX15的剩余18個WOX基因中，Motif 2存在于除TaWOX9、TaWOX2的剩余18個WOX基因中，說明Motif 1、Motif 2在所有的WOX基因的蛋白質基序中最為保守，Motif 1、Mo-tif 2是小麥WOX轉錄因子的核心基序。Motif 5存在于小麥13個WOX蛋白質序列中，Motif 9存在于小麥的11個WOX蛋白質序列中，這說明Motif 5和Motif 9也是相對較為保守的基序。蛋白質基序Motif 1、2、5、9的保守性很可能與小麥WOX基因功能密切相關。TaWOX10、TaWOX12、TaWOX11、Ta-WOX13的蛋白質基序較類似，這與圖1中它們的親緣關系較近的結論相一致。

圖1 小麥WOX轉錄因子系統進化關系和基因結構Fig. 1 Evolutionary relationship and gene structure WOX transcription factors in wheat

圖2 小麥WOX轉錄因子蛋白質基序Fig. 2 Protein motifs of wheat WOX transcription factors

2.4 小麥WOX基因順式作用調控元件分析

WOX 轉錄因子對植物的生長發育、器官形成和干細胞維持等具有重要調控作用。為了探究小麥的WOX 轉錄因子與植物生長發育的關系，我們分析了小麥WOX基因啟動子區域內的順式作用調控元件。結果顯示，小麥16個WOX基因啟動子中的順式作用調控元件主要包括：脫落酸響應順式作用元件（abscisic acid responsiveness cis-acting element，ABRE）、茉莉酸甲酯響應順式作用元件（MeJA-responsiveness cis-acting element，CGTCA-motif）、種子特異調控響應順式作用元件（seed specific regulation cis-acting element，RY-element）、分生組織相關響應順式作用元件（meristem expression cis-acting element，CAT-box）等（表2）。RY-element主要參與種子的發育過程，CAT-box則主要參與分生組織的形成過程（表3）。TaWOX1、TaWOX3、TaWOX4、TaWOX5基因上游1.5 kb區域內都包含了RY-element和CAT-box 2種順式作用元件，說明這幾個基因作為小麥WOX轉錄因子家族的成員，與小麥分生組織的形成相關，也很可能與小麥種子或胚乳的發育密切相關。而TaWOX15、TaWOX16基因上游1.5 kb區域內都包含了GT1-motif和Sp1 2種順式作用元件，說明這2個基因與小麥的光合作用相關。

2.5 小麥WOX基因在不同組織以及不同環境誘導條件下的表達分析

為了探索小麥WOX基因的功能，我們對小麥WOX基因在小麥各個組織部位以及不同環境條件下的表達量數據進行了分析。結果顯示：TaWOX1、TaWOX2、TaWOX3、TaWOX4、TaWOX6、TaWOX8、TaWOX10、TaWOX12、TaWOX19在小麥穗部的表達量較高，推測這9個WOX基因可能參與小麥穗部的發育過程；TaWOX5、TaWOX6、TaWOX8、TaWOX10、TaWOX13在小麥莖中的表達量較高，而在其他小麥組織中的含量相對較低，說明這5個基因參與小麥莖稈的生長發育過程；TaWOX15、TaWOX18、Ta-WOX20在小麥胚乳中的表達量異常高，而在其他組織的表達量幾乎為零，因此這3個基因與小麥胚乳的發育密切相關；TaWOX2、TaWOX14在小麥籽粒的表達量較高，其中TaWOX14在其余組織中表達量低，說明TaWOX2、TaWOX14這2個基因與小麥籽粒的形成關系密切。但是在干旱脅迫處理下，20個小麥WOX基因表達量均不顯著，幾乎為零，說明小麥WOX基因與干旱脅迫下小麥發育不相關。圖3所示為小麥在不同生長發育階段的情況以及WOX基因在不同環境誘導下的基因表達模式。

表2 小麥WOX基因啟動子順式作用調控元件Tab. 2 WOX promoter cis-acting regulatory elements in wheat

表3 小麥WOX基因啟動子順式作用調控元件核心序列及功能Tab. 3 Core sequence and functions of WOX promoter cis-acting regulatory elements in wheat

3 討論

小麥是世界上主要的糧食作物之一，小麥生產對保證我國糧食安全和農業可持續發展具有重要的現實意義和戰略意義［24］。改良小麥的品質，提高小麥的單產量已經成為國內外研究的熱點。全基因組分析目前已成為研究某些物種基因家族最基礎的工具，而轉錄因子因其種類繁多和復雜的作用機制，一直是植物領域研究的熱點之一［25］。前人研究結果表明，植物特有的WOX轉錄因子家族具有多種生物學功能，其家族成員在植物的地上部分、地下部分的發育過程中都發揮著十分重要的作用［1］。

本研究結果顯示，小麥共有26個WOX基因，被Phytozome數據庫收錄且有序列信息的有20個，20個家族成員幾乎都含有65個氨基酸殘基組成的保守的同源異型結構域，同源異型結構域可以識別特異序列的靶基因并發揮調控作用［1］。小麥的20個WOX基因可分為3個亞族，不同亞族內的WOX基因彼此之間的親緣關系較近，并且每個亞族內的各個成員之間，在基因結構或蛋白質基序上都具有較強的相似性。本研究中的順式作用調控元件分析的結果顯示，在TaWOX3、TaWOX4、Ta-WOX5、TaWOX6基因的啟動子中，均包含CAT-box和RY-element這2種順式作用元件，據此推測，這幾個小麥WOX基因作為WOX轉錄因子家族的成員，與小麥分生組織的形成有關，也可能與小麥種子或胚乳的發育有重要的聯系，其具體功能有待后續進一步研究驗證。關于小麥WOX基因在植物各部位的表達數據，其中TaWOX8、TaWOX5、TaWOX6、Ta-WOX10在穗部和莖稈表達量較高，可能調控了小麥穗部和莖稈的發育過程；TaWOX18、TaWOX20、TaWOX15在小麥胚乳中的表達量異常高，而在別的部位的表達量幾乎為零，暗示這3個基因可能與小麥胚乳的形成發育密切相關。小麥產量取決于穗數、穗粒數和粒重3種因素，穗的發育與穗粒數密切相關。不同類型分生組織的時空調控對花序的發育和結構特征非常重要，如小穗分生組織的延遲分化作用會引起分枝的重復發生，可以形成大型穗，進而增加穗粒數。下一步將對WOX轉錄因子基因家族中TaWOX3、TaWOX4、TaWOX5、Ta-WOX6、TaWOX8、TaWOX10、TaWOX15、TaWOX18、TaWOX20基因進行克隆與功能研究，驗證WOX基因是否可以通過調控小麥穗部、胚乳的發育來改良小麥的農藝性狀，進而促進小麥增產。

圖3 小麥WOX基因在不同組織和不同環境誘導條件的基因表達模式Fig. 3 Gene expression patterns of wheat WOX genes in different tissues and conditions

總之，本研究借助于生物信息學中的數據庫檢索與分析，利用生物工具的繪圖功能，鑒定并分析了小麥的WOX轉錄因子基因家族，為后續小麥植物生長發育相關WOX基因的克隆和功能研究奠定了理論基礎。