蛹蟲草遺傳多樣性分析

李 躍 劉 娜 宋 瑩 張季軍 李 紅 肖千明

（遼寧省農業科學院食用菌研究所/遼寧省食用菌優質栽培重點實驗室，遼寧沈陽110161）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）屬子囊菌門，肉座菌目，蟲草科，蟲草屬，又名北冬蟲夏草、北蟲草，是蟲草屬的模式種[1]。研究證明，蛹蟲草含有蟲草素、蟲草酸及多糖等特殊活性物質，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎和免疫調節等諸多生理功效，被用作冬蟲夏草的替代品[2]。酯酶同工酶是食用菌種質資源研究的生化指標之一，可反映出生物間的遺傳信息和進化關系，可作為傳統生物學分類的輔助依據[3]。筆者用酯酶同工酶技術對12個蛹蟲草菌株的親緣關系進行分析，旨在為蛹蟲草菌種管理和種質資源遺傳多樣性的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養基

供試的12個蛹蟲草菌株采用組織分離獲得，編號為C1～C12。

固體培養基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂20 g，蛋白胨10 g，水1 000 mL。

液體菌種培養基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B110 mg，蛋白胨3 g，牛肉膏5 g，水1 000 mL。

表1 供試蛹蟲草菌株編號及來源

栽培種培養基配方：每瓶裝40 g小麥，加入營養液60 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲培養特性試驗

用直徑6 mm 打孔器取活化后的菌種塊接種于直徑9 cm 的固體培養基平板上，置于培養箱內（23±1）℃避光培養。觀察菌絲長勢以及菌絲轉色后的顏色，并計算菌絲平均生長速度[4]。

菌絲平均長速（mm/d）=（[菌落直徑-6）÷2]÷培養時間

1.2.2 收集菌絲

將活化后的菌種在無菌條件下接入20 mm×200 mm的試管中，每個菌株8支，置于（23±1）℃培養箱內，避光培養，待菌絲長滿試管后將菌絲慢慢刮下，注意菌絲不帶有培養基，以免影響后期的試驗數據。每個菌株取0.5 g菌絲，-20 ℃冰凍24 h后備用[5]。

1.2.3 同工酶電泳

采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳方法。將收集的菌絲放入液氮中研磨，并加入0.5 mL 的提取液，研磨后將樣品收集于1.5 mL離心管中，14 938×g離心20 min，取上清液。將上清液與蔗糖溶液按體積比1∶1 混合作為電泳樣品，點樣量45 μL，溴酚藍作為指示劑。4 ℃電泳，初始電壓為100 V/板，進入分離膠后電壓為150 V/板。當溴酚藍指示劑遷移距末端1 cm左右時，停止電泳，染色并保存備用。

1.2.4 酶譜分析

測量相對遷移率（Rf）：相對遷移率Rf=X/Y，X為點樣孔下沿到指示劑前沿的遷移距離，Y為點樣孔下沿到凝膠中酶帶的遷移距離[6]。

菌株間聯合系數（S）分析：兩個菌株之間共同具有的酶帶數與兩菌株所具有的酶帶數之和減去共有酶帶數的比值。S=c（/a+b-c），式中，a和b分別為菌株各自的酶帶總數，c為a、b菌株共有的酶帶數[7-8]。

聚類分析：在相同遷移率位置上，有酶帶記為1，無酶帶記為0，并用DPS 數據處理系統軟件進行聚類分析[9]。

1.2.5 出草比較試驗

栽培容器為750 mL 透明罐頭瓶，每個菌株接種100 瓶。子實體成熟后，供試的12 個蛹蟲草菌株分別隨機選取20瓶，觀察子實體顏色，測定鮮重、干重等，考察蛹蟲草子實體農藝性狀。

2 結果與分析

2.1 供試蛹蟲草菌株菌絲培養特性

由表2 可以看出，菌絲平均長速最快的是C6，其次是 C1，最慢的是 C11；C3、C9、C10 菌絲體濃密，C1、C2、C5、C6、C7、C8 菌絲體較濃密，C4、C11、C12 菌絲體稀；C3、C9、C10 為氣生菌絲且旺盛，C7也為氣生菌絲，其他菌株都是匍匐菌絲；大部分菌株菌絲是橙黃色，只有C2、C3、C11 是淺黃色。

表2 供試12個蛹蟲草菌株菌絲生長情況

2.2 供試蛹蟲草菌株子實體農藝性狀

由表3 可以看出，多數菌株子實體顏色是橙黃色，只有C2、C3、C8、C11 是橘黃色。子實體干重依次為C6＞C1＞C5＞C4＞C2＞C8＞C12＞C9＞C7＞C10＞C3＞C11，鮮品較重的是 C6、C1。C1、C2、C4、C5、C6、C8 菌株子實體整齊，C3、C7、C9、C10、C11 菌株子實體不整齊，C12 子實體較整齊。C1、C11 菌株子實體形態為尖頭，C2、C8菌株為孢子頭，其他菌株為棒狀。

圖1 供試12個蛹蟲草菌株子實體形態

表3 供試12個蛹蟲草菌株農藝性狀比較

2.3 酯酶同工酶酶帶分析

由圖2、圖3 及表4 可以得出，所有菌株共分離出49 條酶帶。按其電泳遷移率（Rf）集中程度由負極向正極可分為A、B 兩個區，各菌株有2～5 條不同的酶帶，多數為 4～5 條，Rf在 0.178～0.680，其中 A 區Rf在0.178～0.296，B區Rf在0.538～0.680。

圖2 供試蛹蟲草菌株的酯酶同工酶圖譜

圖3 供試蛹蟲草菌株的酯酶同工酶模式圖

表4 供試12個蛹蟲草菌株同工酶的譜帶Rf值

12 個蛹蟲草菌株中部分菌株酶帶基本相同，只是酶帶深淺寬窄有所不同，這可能與酶濃度、酶活性有關[10]。在A 區中共有15 條酶帶，酶帶顏色淺，說明酶的活性弱。B 區中共有34 條酶帶，在Rf為0.538、0.550 處酶帶較深，在Rf為 0.601～0.680 處酶帶最深，說明酶的活性強。在 A 區，C9、C10 在Rf為0.178 處有相同的酶帶；C2、C11、C12 在Rf為 0.237處有相同的酶帶；除了C2、C11，其他菌株在Rf為0.296處都有相同的酶帶。在B區，多數菌株在Rf為0.538、0.601、0.630 處有相同的酶帶，說明這些菌株之間有同源性，在主要代謝過程中具有相似的生理性 狀[10]。C1 有 2 條 特 殊 酶 帶 ，Rf分 別 為 0.550、0.604；C2 有 2 條特殊酶帶，Rf分別為 0.621、0.645；C8 有1 條特殊酶帶Rf為0.680，說明這三個菌株與其他菌株親緣關系較遠。

2.4 菌株間親緣關系分析

由相對遷移率可以看出各菌株間親緣關系的遠近，為了更直觀，利用聯合系數（S）可更清楚地反映供試菌株間的親緣關系。由表5 可見，12 個蛹蟲草菌株的遺傳聯合系數在0～1 變化，兩個菌株間聯合系數越小，說明兩者親緣關系較遠，聯合系數越大，說明兩者親緣關系越近[11]。其中菌株C1 與C2、C11 之間，C2 與 C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10 之間，菌株C11 與C1、C3、C4、C5、C6、C7、C9、C10 之間S 為0，說明它們之間親緣關系較遠；菌株C3、C4、C5、C6、C7 之間，C9 與 C10 之間 S 為 1，它們都有 4 條酶帶，位置相同，寬窄不同，顏色深淺稍有差異，說明親緣關系十分相近。

2.5 酯酶同工酶聚類分析

由圖4 可以看出，所有菌株在聚類為0.58 處分為4個類群：第1個類群為C1，與其他菌株親緣關系較遠；第2 個類群包括 C3、C4、C5、C6、C7、C9、C10、C12、C8，其中C3、C4、C5、C6、C7 相異系數（距離系數）為0，C9與C10相異系數為0，說明每組菌株的遺傳背景相似或為同一菌株；第3個類群為C2；第4個類群為C11。在聚類為0.78 時，菌株C1 與第2 個類群歸為一類；C2、C11 歸為一類，說明菌株 C1、C2、C11與其他類群親緣關系較遠。

圖4 供試蛹蟲草菌株的聚類分析

表5 供試12個蛹蟲草菌株同工酶的聯合系數（S）

3 小結與討論

菌絲長勢包括菌絲生長的狀態和速度。優良菌種菌絲長速正常、整齊、濃密、健壯；劣質菌種菌絲生長緩慢、稀、參差不齊、易衰老[12]。供試12 個蛹蟲草菌株的菌絲生長速度、菌絲密度和菌絲形態有一定差異，在生產中匍匐狀菌絲更有利于現蕾；這與秦俊哲的菌株活力較強能出草，其菌絲基本都為白色圓環匍匐狀的研究結果相一致[13]；子實體鮮品、干品較重的為C6、C1 菌株，C1、C2、C4、C5、C6、C8 菌株子實體整齊，子實體的整齊度直接影響到干品的外觀。C1、C11 是尖頭，C2、C8 是孢子頭，其他菌株都是棒狀。綜合比較表現突出的是菌株C6、C1。

酯酶同工酶分析彌補了以子實體形態等特征分類方法的不足[14]。試驗酯酶同工酶酶帶分析共檢測出49條酶帶，Rf在0.178～0.680，從中可以看出，尖頭菌株C1、野生菌株C11、孢子頭菌株C2 與其他菌株親緣關系較遠；C3、C4、C5、C6、C7 菌株相異系數為0，菌株C9 與C10 相異系數為0，說明沈陽當地蛹蟲草種質資源并不豐富，多為相似或為同一菌株，急需選育新品種，這與何華奇收集的4 株沈陽蛹蟲草菌株，遺傳相似系數也在0.88 以上結果基本一致[15]。聚類分析結果與形態特征分析結果基本一致，而聚類分析、同工酶酶譜結果更為直觀、客觀和規范。